[发明专利]一种胞外丙酮酸产量提高的基因工程菌及其应用

权利要求书

1.一种胞外丙酮酸产量提高的基因工程菌，其特征在于，在光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M202019中过量异源表达编码抗逆性蛋白CutA的基因。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码抗逆性蛋白CutA的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.构建权利要求1或2所述的基因工程菌的具体包括以下步骤：

(1)获得外源目的基因：对已知的掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii)抗逆性蛋白CutA核苷酸序列（SEQ ID NO.1），进行优化获得SEQ ID NO.2所示序列；

(2)构建重组表达质粒：全化学合成步骤1）中的SEQ ID NO.2，并克隆至多拷贝表达载体pRS306TEF1中的Bam HI-Eco RI插入位点，获得重组表达质粒pRS306TEF1-CutA；

(3)获得基因工程菌：利用电穿孔转化方法将被分离纯化的重组质粒pRS306TEF1-CutA转化T.glabrata CCTCC M202019△ura3，在YNB培养基平板中筛选原养型细胞。

4.权利要求1或2所述基因工程菌的方法，具体包括以下步骤：

(1)获得外源目的基因：对已知的掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii)抗逆性蛋白CutA核苷酸序列进行优化获得SEQ ID NO.2所示序列；

(2)构建重组表达质粒：全化学合成步骤1）中的SEQ ID NO.2所示序列，并克隆至多拷贝表达载体pRS306TEF1中的Bam HI-Eco RI插入位点，并获得重组表达质粒pRS306TEF1-CutA；化学合成酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)热击蛋白HSP150编码基因的启动子序列，克隆至pRS306TEF1-CutA质粒上的Sac I-Xho I插入位点，替换pRS306TEF1-CutA质粒上的组成型启动子TEF1为温度诱导型启动子，并获得pRS306HSP150-CutA质粒；

(3)获得基因工程菌：利用电穿孔转化方法将被分离纯化的重组质粒pRS306HSP150-CutA质粒转化T.glabrata CCTCC M202019△ura3，在YNB培养基平板中筛选原养型细胞。

5.应用权利要求1或2所述的基因工程菌发酵生产丙酮酸的方法，其特征在于，将所得基因工程菌分布至含有种子培养基的斜面培养基上，并将新鲜培养的斜面培养物接种至含有25mL种子培养基的250mL三角摇瓶中，28℃、200rpmin，培养24小时；按10%(v/v)的接种量接入3L发酵罐中，发酵培养基装液量为1.5L，发酵罐培养条件为通气量4vvm，搅拌转速400r/min，温度30℃，pH值和溶氧通过自动流加泵流加浓度为8mol·L^-1NaOH和2mol·L^-1HCl浓度的溶液维持培养基pH控制在稳定范围内。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述种子培养基成分为：葡萄糖20g·L^-1，蛋白胨10g·L^-1，MgSO₄·7H₂O0.5g·L^-1，KH₂PO₄1g·L^-1，调pH为5.5。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基成分为：葡萄糖100g·L^-1，NH₄Cl7g·L^-1，KH₂PO₄5g·L^-1，MgSO₄·7H₂O0.8g·L^-1，乙酸钠6g·L^-1，烟酸4m g·L^-1，盐酸硫胺素30μg·L^-1，烟酸吡哆醇100μg·L^-1，生物素10μg·L^-1，核黄素50μg·L^-1。培养基初始pH5.0。维生素液过滤除菌后加入。