[发明专利]提高毕赤酵母发酵产磷脂酶C产量的培养基及方法

说明书

本发明提供了一种发酵培养基，该发酵培养基中Mg²⁺含量为1.5‑4.6g/l。使用本发明提供的发酵培养基培养表达磷脂酶C的毕赤酵母，发酵过程中的蛋白酶含量得到有效抑制，目的蛋白磷脂酶C的产酶时间被有效延长，且稳定性得到大幅提高，最终获得发酵液中的磷脂酶C的酶活得到较大提高，甚至可提高4倍以上。

技术领域

本发明涉及磷脂酶C制备领域，具体的，涉及一种提高毕赤酵母发酵产磷脂酶C产量的培养基及方法。

背景技术

磷脂酶C（phospholipase C，简称PLC）是一类可催化水解磷脂C3的磷脂酰键的水解酶。其水解产物甘油二酯是一种生理活性物质，在细胞信号传导途径上起着第二信使的作用，能激活蛋白激酶C（PKC）而引起细胞增殖、分化、收缩、分泌和代谢等功能变化，此外还具有明显的抗血小板粘附、聚集等功能，对抗血小板新型药物及抗静脉血栓医疗方面的研究意义重大。随着对PLC研究的深入及工业发展的需求，PLC的应用价值已经从药品生产延伸到油脂精炼、食品加工、磷脂改性等领域，如：植物油脱胶，面包改性等。而最近PLC作为一种新型食品添加剂势必会推动PLC的广泛应用和研究。

国外对微生物磷脂酶C的研究起源于20世纪60年代，迄今已有多种微生物来源磷脂酶C的基因序列、蛋白结构及催化机理公布于众。产磷脂酶的细菌中Bacillus cereus、C.bifermentants、C.perfringens、L.monocytogenes、P.aeruginosa、B.thuringiensis来源磷脂酶C的基因已经克隆并对其底物特异性及酶学性质等进行了较为深入的研究。其中，B.cereus来源的PLC是一种分子量为23000KD的胞外酶,含有2个锌离子，是一种锌离子依赖型的单金属酶，其酶活和稳定性都依赖于锌离子（Clive little.Effect of somedivalent metal cations on phopholipase C from Bacillus cereus.Acta ChemicaScandinavica B35(1981)39-44）。此外，还有研究者发现(Clive little and anne-britotnass.The metal ion dependence of phospholipase C from bacilluscereus.Biochimica et Biophysica Acta,391(1975)326-333.AbramoC.Ottolenghi.Phospholipase C from bacillus cereus A zinc requiring metalloenzyme.Biochim.Biophys.Acta.106(1965),510-518.Clive little and sisseljohansen.Unfolding and refolding of phospholipase C from Bacillus cereus insolutions of guanidinium chloride.Biochem.J.(1979)179,509-514.Anne-Britotnaess,Clive little,knut sletten,et al.Some characteristics of phospholipasec from bacillus cereus.Eur.J.Biochem.79,459-468(1977))：B.cereus来源的PLC中一个锌离子与酶蛋白紧密结合，另一个比较松散，容易被其他二价金属离子取代，从而造成酶活降低或失活。目前，B.cereus来源的PLC在毕赤酵母中表达的研究比较少，目前主要有Kook等(Kook-Hwa SeoJong Rhee.High level expression of recombinantphopholipase C from Bacillus cereus in Pichia pastoris and itscharacterization.Biotechnology Letters26:1475-1479,2004)将B.cereus来源的PLC基因在毕赤酵母（P.pastoris）进行表达，摇瓶水平上检测了酶活。美国Verenium公司将包括B.cereus来源在内的任何来源的PLC基因在毕赤酵母中的表达都做了保护，并提出了“高的共喂料速率”策略（CN101558154A）。