[发明专利]用于提高体外培养人肝细胞的生理性CYP3A4表达的嵌合基因及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种真核表达载体构建技术，尤其涉及一种用于提高体外培养人肝细胞的生理性CYP3A4表达的嵌合基因及其构建方法。

背景技术

大部分药物进入体内后的代谢过程主要由肝细胞完成。肝细胞含有各种参与体内外物质生物转化的酶类。细胞色素P450酶（CYPs，P450s）是一类含血色素巯基结构的单加氧酶蛋白超家族，是完成相关底物的去毒/生物活化作用的重要药物代谢酶。其中，CYP3A亚家族在人肝脏组织中含量最高，约占30%，是主要的临床药物代谢酶类。CYP3A4参与了50%的临床用药的代谢过程，药物代谢谱非常广泛。鉴于CYP3A4在药物代谢过程中的重要作用，药物研发过程需要一个能够再现体内CYP3A4代谢作用的体外模型，用来集中评价CYP3A4对备选药物代谢作用和水平，以及备选药物对CYP3A4活性作用的影响。

原代人肝细胞是最适合用于药物代谢的CYP3A4体外细胞模型，它完整表达了Ⅰ相、Ⅱ相代谢酶以及其他参与分子，能比较准确地模拟药物在人体内的代谢作用，是体外药物代谢的金标准。原代人肝细胞中CYP3A4表达调控机制的基本内容如下：核因子孕烷X受体(PXR)是调控CYP3A4转录的一个最重要的转录因子，PXR与维甲酸X受体(RXR)α形成异源二聚体，与近孕烷X受体反应元件（prPXRE）及外源性反应增强模块（XREM）等元件发生结合，调控CYP3A4的生理性表达（构成性和诱导性）。

但是由于原代人肝细胞来源短缺，人群差异性大，体外培养细胞表型维持困难等缺点，故广泛应用原代人肝细胞比较困难。相比之下，肝癌细胞系则不存在原代肝细胞来源有限、体外培养困难等缺点，它们具有体外增殖能力，遗传和功能表型相对稳定，并且培养条件比较简单而易于实验室间统一标准。原代肝细胞永生化的方法主要是转染编码肿瘤病毒基因，原癌基因或端粒酶的质粒。随着研究的进展，出现了杂交细胞、条件永生化肝细胞及从转基因动物分离的细胞系。但是，原代肝细胞永生化后，细胞表型发生改变，特别是CYP3A4表达低下，所以并不适合用于CYP3A4相关性药物代谢研究。

肝源性细胞系普遍存在的主要问题是，处于去分化或低分化状态，各类代谢酶表达水平低下或不全。因此，相关改造的核心目标集中在如何恢复和提高肝特征功能表型。另一种改造细胞功能的方法是，通过转染编码CYP3A4的质粒，在细胞系中过表达CYP3A4，提高细胞系在CYP3A4相关性药物代谢的应用潜质。各种各样的非肝源性宿主细胞如细菌，酵母菌，昆虫细胞，哺乳动物细胞等，已经被成功改造。1991年，文献报道在B淋巴细胞样干细胞中成功表达。1998年，Chen Q et al已成功在中国仓鼠肺细胞中表达CYP3A4，并用于黄曲霉素B1，环磷酰胺及杂色曲霉素的代谢研究。Hep G2作为应用最广泛的肝癌细胞系，大量文献报道在Hep G2中成功过表达CYP3A4，并用于CYP3A4相关的药物代谢及毒性研究。但这种过表达CYP3A4的改造方式并不能再现药物代谢酶的生理性反应特点，因此不能用于预测药物相互作用等临床药物治疗学的重要问题。

为实现模拟生理性调控的目的，人们对CYP3A4表达调控机制进行了深入分析研究。对照原代人肝细胞的相关基因表达、调控和酶活性基本参数，有学者发现CYP3A4在细胞系中表达降低与CYP3A4相关的转录因子及辅助因子表达减少有密切相关性。如Hep G2与原代肝细胞相比，C/EBPαmRNA只达到原代肝细胞的15%，HNF3α是25%，HNF1α是40%。有学者通过转染编码特异性转录因子（C/EBPα，HNF3γ，PXR）的质粒，成功在Hep G2提高了CYP3A4的表达。Jenni Küblbeck et al.（2010）改造出了一种嵌合转录因子，即将NF-κB的P65激活域连接至PXR构成嵌合基因，改造C3A细胞，提高其CYP3A4的表达。虽然过表达相关转录因子可以增强CYP3A4的表达，但是仍然远远达不到原代肝细胞的表达水平。因为CYP3A4在细胞内的表达调控是一个多因子参与的复杂的调控网络，单个或若干个转录因子的表达提高，并不能使CYP3A4的表达恢复到正常水平，所以仍需对CYP3A4表达调控做进一步的尝试研究。