[发明专利]通过N端增加二硫键提高米曲霉木聚糖酶热稳定性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株的常温木聚糖酶(AoXyn11A)基因进行热稳定性定向改造，杂合木聚糖酶工程菌的构建及重组杂合木聚糖酶的高效表达的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是一类重要的工业用酶。它主要是作用于木聚糖主链，随机地切开木聚糖内部的木糖苷键，水解产物主要为不同聚合度的木寡糖和少量的木糖，是木聚糖降解酶中最关键的酶。近几年，由于木聚糖酶在饲料工业、食品加工及酿造等行业具有潜在的工业应用和经济价值，尤其是在工业造纸上的应用，减少因漂白产生的环境污染，受到了越来越多的关注。然而在许多工业中，木聚糖酶都需要在高温条件下进行操作，因此对木聚糖酶耐热性的研究也引起了国内外研究的高度重视。开发耐热型木聚糖酶的研究主要包括筛选超耐热的木聚糖酶生产菌和利用基因工程对酶分子进行定向改造，相对于筛菌技术的盲目性，后者具有更强的针对性，受到国内外学者的亲睐。

根据木聚糖酶催化区域的结构和性质分析，可将其分为不同的家族，其中以糖苷水解酶第10家族和第11家族居多。由于G/11家族的木聚糖酶分子量较小，且结构比较简单，更适合作为理论研究的分子模型，可以用于极端条件下木聚糖酶催化模式系统及蛋白质分子折叠机理等的研究。基因工程技术、生物信息学以及计算机科学的快速发展，为分子生物学的研究开辟了新的前景。我们可以运用大规模高性能的计算机及其相关软件，结合基因工程手段，利用模拟试验对酶分子进行定向改造以提高热稳定性，加速木聚糖酶在各种领域中的应用过程。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的利用计算机技术与生物信息学方法对常温的木聚糖酶进行理性设计，运用基因工程的方法构建杂合木聚糖酶工程菌以及重组杂合木聚糖酶的高效表达的方法。将源自A.oryzae CICC 40186的第11家族的木聚糖酶命名为AoXyn11A，其相应的基因命名为Aoxyn11A；采用的模板为同家族的超耐热木聚糖酶，将其命名为EvXyn11^TS，基因序列为本实验室合成基因Syxyn11(GenBank accession NO.JX459567)；由定向改造得到的杂合木聚糖酶命名为AoXyn11A₁，其相应的基因为AoXyn11A₁，其热稳定性有了一定的提高，而酶的活性较原酶而言没有下降，有较大的工业应用潜力以及经济价值。

本发明的技术方案：一种来源于A.oryzae CICC 40186的木聚糖酶基因(Aoxyn11A)在计算机辅助下进行理性设计，得到一种杂合木聚糖酶：AoXyn11A₁，其完整的DNA和氨基酸序列分别称为SEQID NO：1和SEQ ID NO：2。

所述的重组木聚糖酶的活性测定方法：

于25mL具塞试管A和B中，各加入用pH 5.5、柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液配制的质量浓度为0.5％的榉木木聚糖(Sigma，USA)溶液2.4mL，50℃预热10min，在A管中加入0.1mL适当稀释的酶液，50℃准确反应10min；立即各加入2.5mL 3′，5′-二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min；冷却后各加去离子水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从木糖标准曲线上查出相应的还原糖(以木糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量定义为1个木聚糖酶活性单位(IU)。

所述的耐热杂合木聚糖酶基因的设计、克隆及表达：

(1)同源建模模拟AoXyn11A的空间结构：登录蛋白质结构数据库Protein data bank(http://rcsb.org)，经BLAST比对，找到与AoXyn11A具有高度同源序列。本实验选择具有非常高的热稳定的EvXyn11^TS(Protein Data Bank登录号为2VUL)为模板，并且两者的同源性为66.49％，运用SWISS-MODEL服务器在线全自动为AoXyn11A构建空间结构。运用软件Verify 3D对同源建模的结构模型进行评估和优化，获得准确性较高的空间结构模型。