[发明专利]通过N端增加二硫键提高米曲霉木聚糖酶热稳定性的方法

权利要求书

1.一种源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186、归属于糖苷水解酶第11家族的常温木聚糖酶基因Aoxyn11A，以另一个同家族的超耐热木聚糖酶基因Syxyn11(GenBank accession NO.JX459567)模板，利用计算机技术及其相关软件，结合分子动力学模拟的方法，对AoXyn11A分子进行理性设计，定向改造以提高热稳定性。

2.利用分子动力学模拟的方法理性设计热稳定性提高的杂合基因：

(1)同源建模模拟AoXyn11A的空间结构：登录蛋白质结构数据库Protein data bank(http://rcsb.org)，经BLAST比对，找到与AoXyn11A具有高度同源的序列；本实验选择热稳定非常高的EvXyn11^TS(Protein Data Bank登录号为2VUL)为模板，并且两者的同源性为66.49％，运用SWISS-MODEL服务器在线全自动为A.oryzae常温木聚糖酶成熟肽构建空间结构；运用软件Verify_3D对同源建模的结构模型进行评估和优化，获得准确性较高的空间结构模型；

(2)利用分子动力学模拟的方法理性设计热稳定性提高的杂合基因：通过序列比较，我们把EvXyn11^TS前面5个氨基酸(NAQTC)添加到AoXyn11A的N端，再把杂合酶的32位T改为C，然后我们以EvXyn11^TS为模板，对杂合木聚糖酶进行同源建模，再运用分子动力学模拟方法分别对杂合酶和原酶进行总体能量及RMSD值计算，由结果我们得出杂合酶的总体能量和RMSD值相对于原酶而言较小，即热稳定性较好。

3.杂合木聚糖酶工程菌的构建和表达方法：

(1)杂合基因Aoxyn11A₁表达质粒的构建：根据GenBank上Aoxyn11A基因序列(GenBank accessionNo.JQ326257)设计3个引物：

Xyn11-F：5’-CTCGAGAAAAGAAACGCTCAAACTTGTTCCACACCCAGTAGCACGG-3’，含有XhoI酶切位点

Xyn11-Rm：5’-GTATGAACCGCCGTTGCCGTTACAGTAAGTCACATCAC-3’

Xyn11-R：5’-GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAGCAG-3’，含有Not I酶切位点

采用大引物PCR技术对原基因进行定向诱变，主要分为三步：以原基因质粒为模板，采用引物Xyn11-F和Xyn11-Rm，进行PCR首轮扩增(94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min)；对该PCR产物核酸电泳并进行割胶回收，回收产物作为N端引物，C端引物为Xyn11-R，进行第二轮PCR扩增(94℃5min；94℃30s，45℃30s，72℃60s；72℃延伸10min)；将第二轮PCR目的条带进行克隆、测序；测序正确的pUCm-T-Aoxyn11A₁与载体pPIC9K^M(已申请专利，专利号201110410391.0)质粒均用Xho I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K^M-Aoxyn11A₁，并对重组表达质粒进行序列测定；

(2)GS115/Aoxyn11A₁重组子的构建、表达及酶活的测定：用Sac I对pPIC9K^M-Aoxyn11A1进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/Aoxyn11A₁；该工程菌用1.0％甲醇诱导96h，离心上清液为重组木聚糖酶粗酶液，对该酶和原酶的酶学性质进行比较：在0.5％的榉木木聚糖底物、反应时间为10min的情况下，AoXyn11A₁的最适温度由原酶的55℃提高为58℃；55℃预热下，AoXyn11A₁的半衰期由原酶的～4min升到～28min。