[发明专利]一种提高喹乐霉素产量的发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种发酵工艺，具体说是一种提高喹乐霉素产量的发酵方法。 

背景技术

粘细菌( Myxobacteria )是一类具有群体习性和复杂发育史的、革兰氏阴性单细胞的滑行细菌的总称。粘细菌能产生令人惊奇的多样的生物活性化合物，早在 l947年研究者就粘细菌的发酵液能够抑制金黄色葡萄球菌的生长；1973 年终于从粘细菌的发酵液中获得了活性物质——异支链脂肪酸；1977年粘细菌产生的Ambruticin 的化学结构也被确定，该物质抗真菌能力强。粘细菌产生活性次级代谢产物的几率特别高，在可以溶解细菌的2000株粘细菌中，有55%的菌株可以产生生理活性物质；在700株可降解纤维素的粘细菌中，95%的菌株可以产生活性物质。在大约7500株已经分离出来的粘细菌中，发现了100种具有主要骨架和600多种衍生物的化合物，包括芳香类、杂环类、醌类、大环类、聚醚类、多烯类、肽类化合物等。粘细菌产生的活性物质大部分具有抗真菌和抗肿瘤活性， 如Epothilones和Chivosazols等，分别对真核细胞的微管和肌动蛋白起作用，并且2007年美国FDA批准了纤维堆囊菌产生的埃博霉素B的半合成类似物ixabepilone（伊沙匹隆) 用于乳腺癌的治疗。因此，粘细菌是一类新近引起广泛关注但却研究尚少的重要药源微生物类群。 

 喹乐霉素的结构

喹乐霉素（quinoxalone）是从粘细菌标桩菌属发酵液中分离的一种抗肿瘤抗生素，化学命名为5-（6-苯甲基-喹啉-3-基甲基）-6-苯基-3.7-二氧-双环[4.1.0] 庚烷-3-酮，分子式为C₂₉H₂₅NO₃，结构式见如上，该抗生素对多个肿瘤细胞系具有很高的抑制活性，并且对正常细胞具有较低的毒性，因此具有很大的应用前景。目前，喹乐霉素生产的研究尚处于初级阶段，喹乐霉素的产量（约1.2 mg/L）和纯度（30%左右）较低，培养基配方和工艺条件还没有被详细的研究，生产存在很多不足之处，如代谢产物阻遏现象、产物提取分离困难等，针对以上问题，对相关技术进行改进的文献或专利未见报道。

发明内容

本发明针对上述问题的不足，提供一种提高喹乐霉素产量的发酵方法，使喹乐霉素的产量大幅度提高。 

本发明的技术方案如下： 

一株直立标桩菌，其分类命名为直立标桩菌(Stigmatella eracta) LY-122，已保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5514。一种提高喹乐霉素产量的发酵方法，通过对直立标桩菌LY-122发酵培养基和发酵条件的改良，并结合添加前体的方法，使喹乐霉素的产量大幅度提高。

一种提高喹乐霉素产量的发酵方法，其具体步骤如下： 

（1）斜面固体培养

将直立标桩菌(Stigmatella eracta) LY-122接种在固体斜面培养基上，25～35℃培养2~7天，得到斜面固体培养的菌种，备用；

所述的固体斜面培养基配方为：每1000 ml培养基，加入蛋白胨 1.0～5.0g、葡萄糖1.0～5.0g和琼脂 17.0g，余量为水；

（2）摇瓶种子培养

取上述步骤（1）所制备的斜面固体培养的菌种，加入无菌水制成菌悬液，无菌水的加入量按照一环菌种加入3—5ml；将菌悬液接种于液体种子培养基中，接种量为液体种子培养基体积的2～10%，培养温度25～35℃，搅拌速度100～200 r/min， pH 7.0～7.2，培养时间2～5 天，得到摇瓶种子液，备用； 

所述的液体种子培养基配方为：每1000 ml培养基，加入玉米淀粉0.5～5.0g、葡萄糖1.0～10.0g、酵母粉0.5～5.0g、氯化钙 0.5～2.0g和七水硫酸镁 0.5～2.0g，余量为水，pH 7.0～7.2；

（3）发酵罐培养

将上述步骤（2）培养好的摇瓶种子液接种于发酵培养基中，接种量为发酵培养基体积的2～10%，培养温度25～35℃，搅拌速度120～300 r/min，每分钟通入发酵液的空气体积与发酵液的体积比为1：2～1：10，pH 7.0～7.2，培养时间5～10 天，其中，在发酵培养的第三天分别添加已除菌的乙酸钠水溶液、丙酮酸水溶液和甘氨酸水溶液作为前体物质，使其在发酵培养基中终浓度分别达到1.0～10mg/l、1.0～10 ml/l和1.0～10mg/l，然后继续培养，即可得含有喹乐霉素的发酵液；