[发明专利]一种提高喹乐霉素产量的发酵方法

权利要求书

1.一株直立标桩菌，其特征是：分类命名为直立标桩菌(Stigmatella eracta) LY-122，已保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5514。

2.一种用权利要求1所述的直立标桩菌(Stigmatella eracta) LY-122生产喹乐霉的一种提高喹乐霉素产量的发酵方法，其特征在于：其具体步骤为：

（1）斜面固体培养

将直立标桩菌(Stigmatella eracta) LY-122接种在固体斜面培养基上，25～35℃培养2~7天，得到斜面固体培养的菌种，备用；

所述的固体斜面培养基配方为：每1000 ml培养基，加入蛋白胨 1.0～5.0g、葡萄糖1.0～5.0g和琼脂 17.0g，余量为水；

（2）摇瓶种子培养

取上述步骤（1）所制备的斜面固体培养的菌种，加入无菌水制成菌悬液，无菌水的加入量按照一环菌种加入3—5ml；将菌悬液接种于液体种子培养基中，接种量为液体种子培养基体积的2～10%，培养温度25～35℃，搅拌速度100～200 r/min， pH 7.0～7.2，培养时间2～5 天，得到摇瓶种子液，备用； 

所述的液体种子培养基配方为：每1000 ml培养基，加入玉米淀粉0.5～5.0g、葡萄糖1.0～10.0g、酵母粉0.5～5.0g、氯化钙 0.5～2.0g和七水硫酸镁 0.5～2.0g，余量为水，pH 7.0～7.2；

（3）发酵罐培养

将上述步骤（2）培养好的摇瓶种子液接种于发酵培养基中，接种量为发酵培养基体积的2～10%，培养温度25～35℃，搅拌速度120～300 r/min，每分钟通入发酵液的空气体积与发酵液的体积比为1：2～1：10，pH 7.0～7.2，培养时间5～10 天，其中，在发酵培养的第三天分别添加已除菌的乙酸钠水溶液、丙酮酸水溶液和甘氨酸水溶液，使其在发酵培养基中终浓度分别达到1.0～10mg/l、1.0～10 ml/l和1.0～10mg/l，然后继续培养，即可得含有喹乐霉素的发酵液；所述的发酵培养基配方如下：每1000 ml培养基，加入花生饼粉1.0～10.0g、葡萄糖5～15.0g、玉米浆1.0～5.0g、大豆蛋白胨1.0～5.0g、氯化钙0.5～2.0g、硫酸镁 0.5～2.0g和磷酸二氢钾0.5～2.0g，余量为水， pH 7.0～7.2；

（4）、喹乐霉素的提取

采用离心、萃取、大孔树脂柱层析和结晶的方法，从上述步骤（3）所得到的含有喹乐霉素的发酵液中提取喹乐霉素。

3.如权利要求2所述的一种提高喹乐霉素产量的发酵方法，其特征在于：所述的乙酸钠水溶液、丙酮酸水溶液和甘氨酸水溶液的制备方法为：准确称取乙酸钠100mg和甘氨酸100mg，量取丙酮酸100ml，分别溶于100ml去离子水中，经0.45微米滤膜过滤除菌后，备用。

4.如权利要求2所述的一种提高喹乐霉素产量的发酵方法，其特征在于：喹乐霉素提取的具体方法为：取所制备的发酵液，5000～10000转/分钟离心10～15分钟去沉淀得到上清液，在所得上清液中加入上清液体积的1～3%的乙酸进行酸化处理后，用滤纸过滤，滤液用2倍体积的氯仿萃取，得到的氯仿萃取液加入同等体积的质量浓度为1～3%氢氧化钠水溶液，静置1小时，所得的有机溶剂氯仿层通过转蒸发仪45℃旋转蒸发去除溶剂，得喹乐霉素的粗提物；然后在室温下，采用100gHPD300大孔树脂吸附层析，所使用层析柱为3cm×40cm层析柱，洗脱方法为依次用1倍层析柱体积的体积浓度为5%甲醇、2倍层析柱体积的体积浓度为40%甲醇和2倍层析柱体积的体积浓度为80%乙醇洗脱，收集流出量为2.5倍层析柱体积至4倍层析柱体积的洗脱液，洗脱液55℃旋转蒸发浓缩干燥，干燥物再溶解于体积比为1：1～2的丙酮和苯混合液中，于4～10℃条件下，静置1～24小时，析出晶体，晶体45℃干燥后即得纯度为85-90%的喹乐霉素。