[发明专利]转DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的提高青蒿素含量的方法，特别是一种转DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。

背景技术

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾的药物，特别是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能。可见青蒿素是一种极具潜力的天然药物。

目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，不同种植环境和种植品种中其平均含量在青蒿叶片干重的0.01-1％，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高，不具有可行性。有人尝试用组织培养和细胞工程的方法来生产青蒿素，然而青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的0.1％，在芽中最高也只有干重的0.16％，而大多数研究在根中没有检测到青蒿素。因此利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的可行性也不高。

经对现有技术文献检索发现，Waleerat Banyai等在《Plant Cell Tissue and Organ Culture》(植物细胞组织器官培养)，2010年103卷255-265页发表了题为“Overexpression of farnesyl pyrophosphate synthase(FPS)gene affected artemisinin content and growth of Artemisia annua L.”(“过量表达法尼基焦磷酸合酶基因能影响青蒿中青蒿素的含量及青蒿的生长”)的论文，报道通过过量表达法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase，FPS)，使转基因青蒿中青蒿素的含量提高了2.5-3.6倍，但仍然只有1.3％左右。不过，植物基因工程为提高青蒿中青蒿素的含量提供了一条可行的方法。

现有技术中1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR)是青蒿素合成途径中的一个关键酶，是青蒿素代谢工程的重要靶点。采用基因工程手段，用关键酶基因DXR转化青蒿，将打破青蒿素生物合成的限速瓶颈，获得青蒿素高产的青蒿植株，为规模化生产青蒿素提供一条新途径。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种转DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明涉及的关键酶基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、青蒿素提取及含量测定用于本发明，建立了稳定提高青蒿中青蒿素含量的方法，为利用青蒿大规模生产青蒿素奠定坚实的基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：

1、一种转DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，该方法包括如下步骤：

(1)采用基因克隆方法获得青蒿关键酶基因DXR；

(2)把所述DXR基因连结于表达调控序列，构建含DXR基因的植物表达载体；

(3)将所述含DXR基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得含所述DXR基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；

(4)利用所述含DXR基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的整合DXR基因的转基因青蒿植株；

(5)对所述转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。

优选的，在所述步骤(1)中，所述基因克隆方法包括以下步骤：提取青蒿基因组总RNA，将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL反转录获得第一链cDNA，根据SEQ ID NO：1所示的DNA序列，设计扩增出完整编码框的上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQ ID NO：2所示的DNA序列，所述下游引物为SEQ ID NO：3所示的DNA序列，并在所述上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点以便构建表达载体，以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。