[发明专利]转DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法

权利要求书

1.一种转DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，该方法包括如下步骤：

(1)采用基因克隆方法获得青蒿关键酶基因DXR；

(2)把所述DXR基因连结于表达调控序列，构建含DXR基因的植物表达载体；

(3)将所述含DXR基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得含所述DXR基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；

(4)利用所述含DXR基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的整合DXR基因的转基因青蒿植株；

(5)对所述转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。

2.根据权利要求1所述的转DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步骤(1)中，所述基因克隆方法包括以下步骤：提取青蒿基因组总RNA，将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL反转录获得第一链cDNA，根据SEQ ID NO：1所示的DNA序列，设计扩增出完整编码框的上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQ ID NO：2所示的DNA序列，所述下游引物为SEQ ID NO：3所示的DNA序列，并在所述上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点以便构建表达载体，以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。

3.根据权利要求1所述的转DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步骤(2)中，所述构建含DXR基因的植物表达载体包括以下步骤：先构建中间载体pMDT18-dxr，再用XmaI和SacI酶切中间载体pMDT18-dxr和表达载体FSN，回收DXR基因片段和FSN载体大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。

4.根据权利要求3所述的转DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述构建中间载体pMDT18-dxr包括以下步骤：通过高保真酶扩增DXR基因前后分别引入XmaI和SacI酶切位点的基因全长，通过连接酶连接到pMDT18载体上。

5.根据权利要求1所述的转DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步骤(4)中，所述转化包括以下步骤：外植体的预培养；农杆菌与所述外植体的共培养；抗性再生植株的筛选。

6.根据权利要求5所述的转DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述预培养包括以下步骤：青蒿种子用75％乙醇浸泡1min，再用20％NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基中，25℃光照培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。

7.根据权利要求5所述的转DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述共培养包括以下步骤：将所述叶片外植体转到共培养培养基中，滴加含活化好的所述含DXR基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使所述外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3天，以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。

8.根据权利要求5所述的转DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述筛选包括以下步骤：将所述共培养3天的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基上于25℃光照培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽，将所述生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基上培养至生根，即可获得Kan抗性再生青蒿植株。

9.根据权利要求1所述的转DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步骤(4)中，所述PCR检测包括以下步骤：设计合成DXR基因的引物；进行DNA扩增；紫外线下观察，若目的条带为阳性，则该株系即为所述转基因青蒿植株。

10.根据权利要求1所述的转DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步骤(5)中，所述HPLC-ELSD测定包括以下条件：所用色谱柱为C-18反相硅胶柱，流动相选用体积比为70∶30的甲醇∶水，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量20μL，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，放大系数为7，载气压力5bar。