[发明专利]用于提高多能干细胞分化成肝细胞的3维支架

说明书

技术领域

本发明涉及合成或动物来源的3维（3D）生物支架作为基体用于提高hPS（人类多能干细胞）的生长和分化的应用；这些支架适合与现有的细胞培养实验室塑料器皿一起使用。更具体地说，本发明涉及用hPS细胞接种单独的或具有各种生物基质涂层的这些支架，以提高所述hPS细胞分化成肝细胞或肝细胞样细胞类型。本发明还涉及将部分分化的肝细胞祖细胞接种到支架上，以进一步分化成更成熟的肝细胞类型。

发明背景

哺乳动物细胞培养

多年来，哺乳动物细胞培养方法已被改善和标准化，并且允许细胞生长、扩增和分化所需要的条件已被充分确定。细胞可以在无菌塑料表面例如聚苯乙烯上常规培养，所述塑料表面往往与基质涂层一起使用，所述基质涂层被设计成更接近地重现细胞会正常生长的体内环境。在胚胎干细胞的情况下，往往需要饲养细胞层例如小鼠胚胎成纤维细胞层来为营养和支持所述细胞的增殖提供更好的基体。典型地，哺乳动物细胞被培养在通常含有添加剂例如胎牛血清的支持性培养基中，所述培养基除了向细胞提供各种激素和生长因子之外，还含有同样有助于复现细胞生长的理想微环境的许多细胞基质组分。

当前，哺乳动物细胞培养具有各种各样的下游应用，包括它们在基础研究中的应用、它们在药物和毒理学分析中的应用和它们在产生正确折叠的重组哺乳动物蛋白中的应用。最近，哺乳动物细胞培养已被进一步开发用于再生医学领域，由此获取组织例如皮肤真皮层并将其增殖一定的时间段，以便生成更大量的组织以供临床外科用，例如修复外伤性损伤之后的伤口或修复患病的内脏器官。可是，从原代来源获得的细胞在它们进一步增殖的能力方面往往非常有限，并需要复杂的生长培养基配方和生长条件来进行成功培养。由于免疫排斥的问题，它们在再生医学中的应用也有限。

最近，在旨在越过这些障碍的胚胎干细胞研究领域中有许多进展。这种多能干细胞不仅能够几乎无限地增殖，它们还具有分化成构成完全发育的生物体的每种细胞和组织类型的能力。因此，多能干细胞在开发新药的试验中可能是重要的工具，并且因为它们的供应实际上是无限的，因此它们提供了更廉价并且可变性较少的来源。

3D生物支架

多能干细胞分化中的主要挑战之一是控制分化，使得始终产生成熟、功能完全的细胞类型而不是部分分化、不成熟的前体细胞或各种细胞类型的高度异质性混合物。使多能干细胞分化的最简单方式是在2D塑料基体上，但不幸的是，这往往产生缺乏成熟细胞类型的特征性表型的分化细胞。这部分是由于不能复现干细胞在正常胚胎发生期间所经受的条件，正常胚胎发生过程与2D培养物的不同之处在于它当然是在3维中发生的。研究人员试图解决这个问题的一种方式是开发新的3D培养系统，所述新的3D培养系统旨在更忠实地复现细胞在胚胎发生期间所经受的一些条件并让它们以更天然的方式分化。特别是，这样的3D系统允许细胞在更大的程度上彼此相互作用，并允许开发比利用2D细胞培养观察到的任何物体更类似于功能性器官的复杂的多细胞聚集体。

3D系统依赖于生物活性支架的存在，细胞可以接种并可以粘着在所述支架上。这样的支架必须有助于引导细胞以所需的3D构造生长和增殖，并且也可能需要提供帮助细胞形成所需结构的某些分子信号。生物支架的另一个重要要求是它们是可放大的，以便组织生长和细胞分化可以在更大、更经济的规模上进行。支架可以由各种材料构成，正确的支架选择在引导接种到其上的任何细胞的生长、增殖和分化中可能是关键的。例如，支架通常由安排成多孔海绵形式的聚合材料构成。于是，接种到这种支架中的细胞可以通过支架内部相互连接的管道和通道网络在所述支架的孔结构内部粘着和生长，当选择适合的支架时，孔径是重要的考虑因素。生体活性剂例如细胞外基质（ECM）组分，在沉积到支架表面上时，也可以用来增强支架功能，以容许更好的细胞粘着。最终的结果是为细胞提供一种体外环境，使细胞可以在其中更切实可行地并且以更接近地类似于它们正常的体内家园的方式进行相互作用。