[发明专利]用于提高多能干细胞分化成肝细胞的3维支架

权利要求书

1.用于将人类多能干细胞（hPS）或肝细胞前体细胞分化成肝细胞祖细胞、肝细胞样细胞或成熟肝细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

i）在2维表面上接种和生长hPS或肝细胞前体细胞以起始分化

ii）将步骤i）的初始分化的细胞转移到3维（3D）支架上用于进一步分化和成熟。

2.权利要求1的方法，其中细胞在3D支架上的接种密度高于在2D培养物上的接种密度，例如高三倍或高五倍或高十倍。

3.权利要求1的方法，其中在细胞存活因子例如ROCK Rho激酶抑制剂的存在下接种细胞。

4.前述权利要求任一项的方法，其中在无饲养细胞的条件下执行步骤i）或ii）中的至少一个。

5.前述权利要求任一项的方法，其中在无异源的条件下执行步骤i）或ii）中的至少一个。

6.前述权利要求任一项的方法，其中hPS细胞或肝细胞前体细胞是无异源的细胞，例如来源于无异源的hPS细胞系。

7.前述权利要求任一项的方法，其中hPS细胞是人类胚胎干（hES）细胞。

8.前述权利要求任一项的方法，其中hPS细胞是诱导的多能干（iPS）细胞。

9.权利要求1-6任一项的方法，其中肝细胞前体细胞是定型内胚层（DE）细胞。

10.权利要求1-6任一项的方法，其中肝细胞前体细胞不是定型内胚层（DE）细胞。

11.权利要求1-6任一项的方法，其中肝细胞前体细胞具有胚胎内胚层的特征。

12.权利要求1-6任一项的方法，其中肝细胞前体细胞具有肝内胚层的特征。

13.前述权利要求任一项的方法，其中在2至25天、例如4至15天之后，将步骤i）中获得的细胞转移到3D支架上（步骤ii）。

14.前述权利要求任一项的方法，其中3D支架选自下列之一：

i）多孔藻酸盐海绵

ii）可生物降解的聚氨酯脲（PUUR）聚合物

iii）乳液模板型聚苯乙烯

iv）合成纳米纤维复合物

v）具有至少一个非直立侧壁的微孔装置

vi）由聚L-乳酸[PLLA]制造的多孔海绵。

15.权利要求14的方法，其中3D支架是孔径为50-200μΜ的多孔藻酸盐海绵。

16.权利要求14的方法，其中3D支架是孔径在0.11000μΜ、例如15-45μΜ范围内的乳液模板型聚苯乙烯支架。

17.前述权利要求任一项的方法，其中3D支架是未涂覆的。

18.权利要求1-16任一项的方法，其中用一种或多种细胞外基质组分预先涂覆3D支架。

19.权利要求18的方法，其中一种或多种细胞外基质组分选自：明胶、层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白、聚赖氨酸、玻连蛋白、透明质酸、透明质酸水凝胶、丝纤蛋白、壳聚糖、或任何前述项的复合物。

20.前述权利要求任一项的方法，其中支架被包含在合适的培养容器内，所述培养容器例如多孔板，包括但不限于6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、384孔板、1536孔板，或其他合适的细胞培养容器。

21.前述权利要求任一项的方法，其中如由一种或多种CYP标志物例如CYP2C9或CYP3A的表达增加所显示的，肝细胞或肝细胞祖细胞表现出代谢活性升高。

22.前述权利要求任一项的方法，其中肝细胞或肝细胞祖细胞表现出一种或多种肝相关转运蛋白例如BSEP、FABP1、MRP2、NTCP、OATP2、OCT1的表达增加。

23.前述权利要求任一项的方法，其中肝细胞或肝细胞祖细胞与非肝细胞相比的比例大于5%，例如10%、例如20%、例如30%、例如40%、例如50%、例如60%、例如70%、例如80%、例如90%、例如100%。