[发明专利]一种提高红麻子叶不定芽诱导率的方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，具体涉及一种红麻组织培养中子叶不定芽的诱导方法。

背景技术

红麻（kenaf，Hibiscus cannabinus L.）具有纤维产量高、适应性广、抗逆性强、耐旱、耐盐碱、耐粗放、速生和易栽培等特性。它不仅被公认是可替代木浆的造纸原料，也是传统的麻纺的重要工业原料作物。我国红麻育种单产水平和栽培总面积及总产居世界首位，其生物产量为森林的3-4倍，CO₂吸收能力为森林的4-5倍，4个月生长周期内干物质积累可达22.5t/ha，排氧量为26557.5Kg/ha，CO₂吸收量达36517.8Kg/ha，被誉为21世纪发展低碳经济，保护生态环境的优势作物，倍受国际社会的重视和青睐。

植物组织培养经过百余年的发展，已经成为生物科学中一项不可或缺的技术，它对提高作物育种或遗传转化效率有重要的科学意义。我国麻类组织培养在快速繁殖、花药培养、原生质体培养、体细胞胚发生、器官发生等研究方面取得了一定的进展。但是这些技术都不太完善和成熟，尚未形成一套成熟、稳定、高效的再生系统，这也成为了红麻转基因育种滞后和制约发展的瓶颈。所以建立一套成熟、稳定、高效的红麻再生体系，对红麻的转基因育种具有重要意义。

在红麻组织培养中，虽有利用多种植物激素进行不定芽增殖的研究。如TDZ、NAA、6-BA、2,4-D、IBA、KT等，但是关于其他调节因子的研究较少。在组织培养中，外植体不定芽的增殖率，往往成为评判一个组培体系优劣的标准。离体培养的植物会产生和散发乙烯，而乙烯在培养容器中的积累会影响培养物的生长和增殖，AgNO₃中的Ag^＋通过竞争性地结合于细胞膜上的乙烯受体蛋白，从而抑制乙烯的活性。本发明针对AgNO₃在红麻不定芽诱导中的影响进行研究，这在红麻组织培养中尚属首例。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高红麻子叶不定芽诱导率的方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

本发明的提高红麻子叶不定芽诱导的方法，以红麻种子无菌苗子叶为外植体材料进行不定芽诱导、增殖，不定芽诱导培养基为：MS+0.1-3mg/L TDZ+ 0.01-1mg/L NAA+0.1-3mg/L AgNO₃，不定芽诱导培养基为：MS+2mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+100mg/L LH。以上不定芽诱导、增殖的培养条件均以光、暗培养时间分别为14h和10h循环进行、光照强度为20000LX、温度为26±1℃的条件进行培养。

所述方法的具体步骤包括：红麻种子经消毒、无菌处理后， 于MS培养基上进行光、暗培养，在光、暗培养时间分别为14h和10h循环进行、光照强度为20000LX、温度为26±1℃的条件下培养7-10d，然后将完整子叶切割成3-5×3-5mm²的长条接种在不定芽诱导培养基上培养30-40d，再将诱导培养后的子叶转接于不定芽增殖培养基中进行不定芽的增殖。

增殖后产生的不定芽用于诱导植株再生，操作方法为：当不定芽生长至3-4cm时，将不定芽从外植体上切割下来，分割成单株的无根苗接种于不定芽生根培养基：MS+0.05mg/L NAA，诱导产生根，即可形成完整的植株。

所述不定芽诱导培养基的配制包括以下步骤：

（1）将MS中的大量元素、微量元素、铁盐、有机物以及蔗糖混合；

（2）加入TDZ、NAA,用蒸馏水定容，pH值用1mol/L NaOH调至5.8-6.0；

（4）溶液分装至锥形瓶中，加入琼脂粉；

（5）0.1Mpa、121℃高压灭菌20min；

（6）冷却至50-60℃，在超净工作台中操作，加入AgNO₃，然后分装到无菌的培养瓶中即为不定芽诱导培养基。

所述不定芽增殖培养基的配制包括以下步骤：

（1）将MS中的大量元素、微量元素、铁盐、有机物以及蔗糖混合；

（2）加入6-BA、IBA，用蒸馏水定容，pH值用1mol/L NaOH调至5.8-6.0；

（3）溶液分装至锥形瓶中，加入琼脂粉；

（4）0.1Mpa、121℃高压灭菌20min；

（5）冷却至60℃左右，在超净工作台中操作，加入水解乳蛋白LH，然后分装到无菌的培养瓶中即为不定芽增殖培养基。

所述不定芽生根培养基的配制包括以下步骤：