[发明专利]利用竞争性微生物提高埃博霉素发酵产量的方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及利用竞争性微生物及其代谢产物诱导纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)提高埃博霉素(epothilone)发酵产量的方法及其在抗生素发酵生产中的应用，属于微生物技术领域。

背景技术

埃博霉素是一类由粘细菌纤维堆囊菌合成的大环内酯类化合物，具有促微管聚合活性，其作用机制类似于紫杉醇紫杉醇及其类似物是目前临床上最为成功的抗肿瘤化疗药物，被用于卵巢癌、胸腺癌、肺癌和肝癌等实体癌的治疗，是美国FDA认定的实体瘤化疗首选药物。紫杉醇虽然广为采用，但仍然有一些缺点，如水溶性低，毒副作用明显，易产生耐药性等等，在一定程度上限制了其应用。而埃博霉素与紫杉醇相比则具有如下明显的优势：①分子结构简单，水溶性更好；②其噻唑环结构与微管作用更加紧密；③不会产生长期使用紫杉醇类药物带来的白细胞减少，脱发等症状；④具有比紫杉醇更广泛的抗肿瘤谱，一般比紫杉醇的抗肿瘤活性高5-25倍；⑤具有对多重耐药性及耐紫杉醇肿瘤细胞的很高的细胞毒活性，比紫杉醇强2000-5000倍；⑥是目前发现的唯一一种由微生物产生的促微管聚合活性化合物，可以通过发酵进行大规模制备，不必像紫杉醇那样必须通过对杉树的采伐或者复杂的化学合成途径来获取。因此埃博霉素被认为是紫杉醇类抗肿瘤化合物的更新换代产品。目前已经发现了多种埃博霉素结构类似物，而且目前已经有多种埃博霉素类化合物进入不同阶段的临床评估，如BMS-247550、BMS310705、KOS-862以及ZK-EPO等，它们均为纤维堆囊菌的发酵产物或者发酵产物的化学衍生物。埃博霉素已经成为目前生物医药方面令人兴奋地研究热点之一，目前其发酵产量的较低是制约埃博霉素应用的瓶颈。

目前针对微生物药物发酵产量提高主要有两种策略，即传统手段育种和发酵条件优化，对工业菌株进一步采用传统育种方法让产量大幅提高的潜力不大，而另外一些遗传背景不清晰或操作手段不完善的菌株如纤维堆囊菌，菌种改良方法效率也不高；发酵条件优化作为提高产量的另一关键技术也已经在几乎所有发酵生产过程中被引入，但是菌株对营养物质的代谢能力有限，我们不可能通过发酵条件优化方法无限制的提高产量。当某些菌株经过不断地育种或发酵条件优化试验后，产量达到某一瓶颈，采用这两种手段很难再有突破。

发明内容

本发明针对传统育种手段和发酵条件优化提高抗生素产量方法上的一些不足，以纤维堆囊菌发酵生产埃博霉素为材料，提供了一种使用竞争性微生物及其代谢产物有效刺激提高抗生素产量的方法，以及该方法在一些抗生素发酵工艺中的应用。

本发明的技术方案如下：

埃博霉素生产菌株为纤维堆囊菌So0157-2，该菌种由山东大学微生物技术国家重点实验室李越中教授提供，目前保藏于中国典型微生物保藏中心(CCTCC)，编号NO.M208078。

竞争性微生物为本课题组自行筛选得到的与纤维堆囊菌So0157-2存在竞争性生存关系的少根根霉(Rhizopus arrhizus)ATCC56015菌株和斜卧青霉(Penicillium decumbens)UC086(中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC 4075)。少根根霉菌株在马铃薯琼脂平板培养基(PDA)上生长，菌落圆形，扩展，最初2天菌丝体为白色生长密集。菌落表面平坦，孢子成粉状覆盖菌落表面，菌落与培养基结合紧密。显微镜下观察菌丝体透明，菌丝无隔、多核、分枝状，在假根的上方长出一至数根孢囊梗，顶端长球形孢子囊。囊的基部有囊托，中间有球形或近球形囊轴。囊内产大量孢囊孢子，成熟后孢囊壁消解或破裂，释放球形或卵形等孢囊孢子。斜卧青霉菌株在马铃薯琼脂(PDA)平板培养基上生长，菌落圆形，扩展，最初2天菌丝体为白色生长密集。菌落表面平坦，孢子呈粉状覆盖在菌落表面，整个菌落与培养基结合很紧密，菌落背面呈暗黄色。显微镜下观察菌丝体透明，分枝多且有横隔，顶端的分生孢子梗不对称分布，分生孢子梗呈扫帚状，分生孢子呈圆形或椭圆形，表面光滑呈灰绿色(图3)。

1.上述竞争性微生物菌株的发酵产物制备方法步骤如下：

(1)将菌株接种于活化培养基，培养条件：温度27～29℃，培养3～4天，得活化后的菌株。

(2)取活化后的菌株接种于营养培养基中，于25～35℃、100～300r/min的培养条件下培养2～4天。

(3)向发酵液中按体积比1∶1加入乙酸乙酯，200r/min搅拌抽提3小时，重复2次后将乙酸乙酯相合并，真空干燥。