[发明专利]用于提高杆状病毒对哺乳动物细胞转导效率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒转导技术领域，特别是涉及一种用于提高杆状病毒对哺乳动物细胞转导效率的方法。

背景技术

杆状病毒（AcMNPV）可以通过内吞途径转导哺乳动物细胞，在内吞体的酸性环境下，病毒包膜表面的膜融合蛋白GP64诱导病毒包膜和内吞体膜发生融合并将病毒核衣壳释放到细胞质中并最终完成转导。AcMNPV的转导可以广泛应用于外源基因的导入和表达。

目前的转导技术主要还是以高滴度的病毒和细胞孵育为主。这种方法需要高滴度的病毒才能达到较为理想的转导效率，前期需要扩增大量病毒并需要超速离心等制备过程，操作复杂，耗时长。近年来也有通过在病毒表面展示外源蛋白来提高转导效率的报道，但是这需要对病毒进行额外的基因操作，目前尚未有一种简单快速的提高AcMNPV转导效率的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种简单快速的用于提高杆状病毒对哺乳动物细胞转导效率的方法。

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

本发明提供的用于提高杆状病毒对哺乳动物细胞转导效率的方法，包括准备工作、病毒的构建、病毒的扩增、滴度测定和在低pH诱导下的转导。

本发明采用包括以下步骤方法实现单纯低pH诱导AcMNPV对哺乳动物细胞的转导：

细胞和病毒的预处理：将细胞培养基换成含终浓度氯化铵的无血清DMEM培养基，在37℃下孵育25～35 min，然后将细胞放置到4℃继续孵育12～18 min；将病毒用中性pH的PBS（pH7.4）稀释后放置在冰上预冷至少15 min；所述终浓度氯化铵为10mM的人肝癌HepG2细胞系（后简称为HepG2细胞）或25mM的人宫颈癌HeLa细胞系（后简称为HeLa细胞）；

病毒和细胞的结合：将预冷完成的病毒和细胞在4℃孵育50～60 min，期间间隔12～18分钟轻微晃动培养皿；

低pH诱导膜融合：孵育结束后，弃掉病毒上清，用预冷的普通中性pH的PBS洗涤细胞2次，然后加入室温的酸性PBS缓冲液，在室温诱导4～6分钟；诱导之后弃去酸性PBS缓冲液，用中性pH的PBS洗涤细胞，加入无血清DMEM培养基，在37℃继续培养1.8～2.2小时，最后将培养基换成不含氯化铵的10%胎牛血清的DMEM，并且在37℃培养。

所述酸性PBS的pH可以为4.4-5.6。

在上述病毒和细胞的结合过程中，病毒和细胞的吸附温度可以为2-6℃。

本发明提供的上述用于提高杆状病毒对哺乳动物细胞转导效率的方法，其与丁酸钠联用，使AcMNPV作为载体进行外源蛋白的表达。

与丁酸钠联用时，可以采用包括以下步骤方法实现AcMNPV对哺乳动物细胞的转导：

细胞和病毒的预处理：将细胞培养基换成无血清DMEM培养基，将细胞放置到4℃继续孵育12～18 min；将病毒用中性pH的PBS稀释到MOI为100，并放置在冰上预冷至少15 min；

病毒和细胞的结合：将预冷完成的病毒和细胞在4℃孵育50～60 min，期间12～18min轻微晃动培养皿；在病毒和细胞的结合过程中，病毒和细胞的吸附温度为2-6℃。

低pH诱导膜融合：孵育后，弃掉病毒上清，用预冷的中性pH的PBS洗涤细胞2次，然后加入室温的酸性的PBS缓冲液，在室温诱导4～6 min；诱导之后弃去酸性的PBS缓冲液（pH为4.4-5.6），用中性pH的PBS洗涤细胞，加入所述无血清DMEM培养基，在37℃继续培养4-6小时，最后将培养基换成含有丁酸钠的10%胎牛血清的DMEM，并且在37℃培养；所述终浓度丁酸钠为10mM的非洲绿猴肾VeroE6细胞系（后简称为VeroE6细胞）或人胚肾293T细胞系（后简称为293T细胞）。

本发明和现有的转导技术手段相比，有以下技术优势：

其一.不需要对病毒进行复杂的基因操作，本技术手段不需要对病毒基因组进行任何操作。技术评估时向病毒中插入报告基因，实际应用不需要此操作。

其二.整体手段简单易操作，没有显著延长实验时间。

在正常的转导步骤之外，只需要增加一个5分钟的低pH诱导步骤，即单纯低pH诱导；或者在转导前再增加一个45分钟的氯化铵预处理步骤，即低pH诱导合并氯化铵处理。

其三. 转导效率高：