[发明专利]用于提高杆状病毒对哺乳动物细胞转导效率的方法

权利要求书

1.一种用于提高杆状病毒对哺乳动物细胞转导效率的方法，包括准备工作、病毒的构建、病毒的扩增和滴度测定，其特征是还包括在低pH诱导下的转导，其采用包括以下步骤方法实现单纯低pH诱导AcMNPV对哺乳动物细胞的转导：

细胞和病毒的预处理：将细胞培养基换成含终浓度氯化铵的无血清DMEM培养基，37℃孵育25～35 min，然后将细胞放置到4℃继续孵育12～18 min；将病毒用中性pH的PBS稀释后放置在冰上预冷至少15 min；所述终浓度氯化铵为10mM的人肝癌HepG2细胞系或25mM的人宫颈癌HeLa细胞系；

病毒和细胞的结合：将预冷完成的病毒和细胞在4℃孵育50～60 min，期间间隔12～18分钟轻微晃动培养皿；

低pH诱导膜融合：孵育结束后，弃掉病毒上清，用预冷的普通中性pH的PBS洗涤细胞2次，然后加入室温的酸性PBS缓冲液，在室温诱导4～6分钟；诱导之后弃去酸性PBS缓冲液，用中性pH的PBS洗涤细胞，加入无血清DMEM培养基，在37℃继续培养1.8～2.2小时，最后将培养基换成不含氯化铵的10%胎牛血清的DMEM，并且在37℃培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述酸性PBS的pH为4.4-5.6。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是在病毒和细胞的结合过程中，病毒和细胞的吸附温度为2-6℃。

4.一种基于权利要求1至3中任一权利要求所述方法的应用，其特征是该方法与丁酸钠联用，使AcMNPV作为载体进行外源蛋白的表达。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征是采用包括以下步骤方法实现AcMNPV对哺乳动物细胞的转导：

细胞和病毒的预处理：将细胞培养基换成无血清DMEM培养基，将细胞放置到4℃继续孵育12～18 min；将病毒用中性pH的PBS稀释到MOI为100，并放置在冰上预冷至少15 min；

病毒和细胞的结合：将预冷完成的病毒和细胞在4℃孵育50～60 min，期间12～18min轻微晃动培养皿；

低pH诱导膜融合：孵育后，弃掉病毒上清，用预冷的中性pH的PBS洗涤细胞2次，然后加入室温的酸性的PBS缓冲液，在室温诱导4～6 min；诱导之后弃去酸性的PBS缓冲液，用中性pH的PBS洗涤细胞，加入所述无血清DMEM培养基，在37℃继续培养4-6小时，最后将培养基换成含有丁酸钠的10%胎牛血清的DMEM，并且在37℃培养；所述终浓度丁酸钠为10mM的非洲绿猴肾VeroE6细胞系或人胚肾293T细胞系。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征是所述酸性PBS的pH为4.4-5.6。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征是在病毒和细胞的结合过程中，病毒和细胞的吸附温度为2-6℃。