[发明专利]提高维生素K依赖性蛋白质的表达产量的方法

说明书

维生素K参与蛋白质中某些谷氨酸残基的羧化以形成γ-羧基谷氨酸残基(Gla-残基)。经修饰的残基位于称为Gla结构域的特定蛋白质结构域内。Gla-残基通常参与钙结合。Gla-残基是所有已知Gla-蛋白的生物活性所必需的。

在过去30年已阐明了如何将维生素K用于把Glu转化成Gla的生物化学法。在细胞内，维生素K通过维生素K环氧化物还原酶(VKOR)被电子还原成维生素K的还原形式(称为维生素K氢醌)。编码VKOR的基因(VKORC1)最近已被鉴定，并且详细地描述于Rost等人，2004((2004)Nature，427，537-541))中。随后另一种酶氧化维生素K氢醌以使Glu羧化成Gla；该酶称为γ-谷氨酰羧化酶或维生素K依赖性羧化酶(VKGC)。只有这种羧化酶能够同时将维生素K氢醌氧化成维生素K环氧化物时，羧化反应才进行；羧化和环氧化反应据认为是偶联反应。维生素K环氧化物随后被维生素K环氧化物还原酶再转变成维生素K。这两种酶包含所谓的维生素K循环(维生素K)。http://en.wikipedia.org/wiki/Vitamin_K-cite_note-Stafford-28#cite_note-Stafford-28。

目前，已在一级结构水平上表征了下列人含Gla蛋白质：凝血因子II(凝血酶原)、VII、IX、X、抗凝蛋白C和S及因子X靶向蛋白Z，以及骨Gla-蛋白质骨钙素、抑制钙化的基质Gla蛋白(MGP)、调节细胞生长的生长抑制特异性基因6蛋白(Gas6)以及功能仍然未知的4种跨膜Gla蛋白(TMGP)。Gas6可用作激活Axl受体酪氨酸激酶和刺激细胞增殖或阻止某些细胞的细胞凋亡的生长因子。在其功能已知的所有情况下，此类蛋白质中的Gla残基的存在显示是功能活性所必需的。多个Gla残基允许Gla-结构域经历构象变化，所述构象变化是维生素K依赖性蛋白的活性以及对磷脂膜表面的结合所必需的。

维生素K依赖性凝血蛋白质需要完全或几乎完全羧化来在钙离子存在的情况下结合膜表面。如果维生素K拮抗剂抑制γ羧化，那么羧化不全的维生素K依赖性蛋白不能形成钙依赖性结构，这导致对磷脂膜的低亲和力和较低的活性。B型血友病患者中发现的羧化不全因子IX突变体的前凝血剂活性丧失可归因于受损的钙诱导构象变化和结合磷脂小囊泡的能力的丧失。

生物技术已提供了产生低成本生物药剂产品的希望。关于凝血因子，这提供了为更广泛的血友病患者提供充分治疗的机会。不幸地，该希望主要因天然存在的生物分子的固有复杂性和多种与它们的重组蛋白质对应物在基因工程改造的细胞中的合成相关的限制而未得到满足。

本申请针对的是对产生维生素K依赖性蛋白例如因子IX或因子IX或因子VII/VIIa的方法的需要，所述蛋白已被适当加工以便它们具有活性并且对于商业生产来说具有足够的产率。为了增加维生素K依赖性凝血蛋白的可用度(以满足对出血障碍例如B型血友病的治疗的世界范围内医学需要)，提高完全功能性蛋白质的产量，在本实例中需要来自基因工程改造的细胞的因子IX。具体地，需要鉴定和补充获得基本上完全的翻译后修饰所需要的酶促活性的缺乏。

因此，存在对在宿主生物中增加维生素K依赖性蛋白的表达，特别是重组表达，从而导致表达的维生素K依赖性蛋白的分泌速率和/或活性提高的强烈需求。

在人因子IX的情况下，γ-羧化蛋白质的重组过表达显示对更高的分泌率下前肽切割和γ-羧化的限制，从而当维生素K在培养基中可过量获得时，也产生只被Gla残基部分占据的蛋白质。这导致分泌活性减小的维生素K依赖性重组蛋白变体。维生素K向培养基的加入在高表达水平上不增加因子IX活性。已显示为了引发活性因子IX而需要存在于细胞培养基中的维生素K达到5μg/ml的饱和度。低于该水平，活性因子IX从中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的分泌量依赖于维生素K浓度(Kaufman，R.J.等人(1986)，J.Biol.Chem.，261，9622-9628)。

维生素K和维生素K类似物构成一组具有共同的2-甲基-1，4-萘醌结构(称为甲萘醌)的亲脂性、疏水性维生素。

维生素的维生素K族的所有成员共有甲基化的萘醌环结构，并且在于3位置连接的脂肪族侧链中变化。

植物和蓝细菌(cyanobacteria)(几乎不变地)只合成一种称为叶绿醌(phylloquinone)(也称为维生素K₁)的化学形式，其具有与叶绿素中相同的植基(phytyl)侧链。