[发明专利]用于提高基于固相的生物测定中信号可读性的信号产生和信号定位的方法

说明书

本发明涉及例如体液等液体样品中的分析物的测定，分析物例如抗原。更具体而言，本发明涉及用于检测体液中分析物的非催化性方法，体液例如尿液、血液、血清、血浆、唾液或粪便的提取液，所述方法使用在使用固相平台的床旁(point of care，PoC)测试装置(例如侧流装置)中包含可检测物质的缀合物。本发明也可应用于非临床的情形，例如检测食物和水的污染物，或者用于兽医领域或军事。

本发明使用载体介质以携带用于测定中信号产生和信号定位的不同的试剂。载体介质包含：

(i)溶剂(例如，水溶液，包括缓冲液、盐溶液、水；有机溶剂，例如乙醇、丙醇等醇；醚，例如四氢呋喃(THF)，及极性非质子溶剂，例如二甲基亚砜(DMSO)；

(ii)增稠剂，其作为胶体混合物溶解在溶剂中，该胶体混合物形成赋予所得的从高粘度流体到凝胶的特性范围内的载体介质特性的内部结构。凝胶型载体介质具有固体外观，但是主要由溶剂组成。实例包括：聚合物，例如聚丙烯酰胺和聚异丁烯；多糖，例如淀粉、纤维素、获自褐藻的藻酸盐、琼脂、角叉菜胶、果胶；天然胶，例如槐树豆胶和瓜尔豆胶；蛋白质，例如胶原、白蛋白和明胶。

在一些实施方案中，载体介质也可包含信号显示剂，其是将信号前体分子转变为产生可检测信号的状态的物质。在其他实施方案中，信号显示剂并不是必需的，因为多个信号前体分子通过物理方法转变为多个可检测的信号分子，物理方法例如温度变化、pH变化、声处理(sonication)、光辐射或微波加热。

载体介质的功能为：

(i)阻止信号分子扩散，导致信号积累。

(ii)提高固相平台上信号的可读性(清晰度、信号保留时间的延长)，并从而提高灵敏度。

在一些实施方案中，其中多个信号前体分子转变为多个可检测的信号产生分子是由化学或生化方法所引起，载体介质具有第三种功能：

(iii)通过将多个信号前体分子转变为多个可检测的信号产生分子而产生信号。

对于使用可见光检测的测定，载体介质基本上为光学透明的。

许多类型的靶标-受体测定已经用于检测体液中各种靶物质的存在情况，体液例如尿液、血液、血清、血浆、唾液或粪便提取液。这些测定通常包括抗原抗体反应，带有放射性的、酶的、荧光的、发光的、化学发光的或视觉上可观察的金属标签的合成缀合物，并使用专门设计的反应室。在所有的这些测定中，存在对选择的靶标(例如抗原)特异的受体(例如抗体)，和用于检测靶标-受体反应产物的存在情况且通常是检测其量的工具。许多目前的测试设计为提供半定量或定量测定，但在许多情况下，所需要的是提供靶标物类存在情况的阳性或阴性表示的定性检测。这种定性测定的实例包括血型测定、大多数类型的尿分析和非常重要的作为直肠癌筛查测定的大便隐血测试。对于这些测试，优选视觉上可观察的指示，例如有色颗粒(例如金颗粒)的积累、存在凝集或者颜色改变。

然而，由于在测试液中受关注的靶标浓度常常低，定性测定必须是非常灵敏的。已开发夹心测定和使用金属溶胶或其他类型的有色颗粒的其他灵敏的检测方法。然而，这些技术并没有解决在快速检测法中遭遇的所有问题，且一直在寻求进一步的改进。

举例来说，在侧流夹心测定中，胶体金常常用作第一抗体(1)的标记，而另一抗体(2)固定在膜(例如硝酸纤维素膜)上的界限明确的检测部位。如果所述分析物存在于样品中，那么分析物与金标记抗体(1)反应并迁移至硝酸纤维素膜结合的抗体(2)。在此就形成夹心，然后将这些夹心复合物收集和浓缩在检测部位中。通过与银离子的另外反应，可使该部位更加可见至一定的程度(放大的)。

然而，分析灵敏度并不显著并且此技术并不容易应用于某些测定，例如测定低(但诊断学上非常重要)的浓度范围内的促甲状腺激素(TSH)、前列腺特异性抗原(PSA)、肌钙蛋白I或肌钙蛋白T。

因此，为了使这些测定更有效，使用了其他标记(称为“信号放大前体分子”)，其在测定反应结束时能被放大，例如在夹心：抗体(2)_固定的-分析物-{抗体(1)-标记}形成结束时。

如果放大标记是包含结晶荧光素二乙酸酯(FDA)的微胶囊(由数百万个FDA分子组成)，那么通过分解微胶囊和水解非发荧光的FDA分子为发荧光的荧光素分子在测定反应后完成放大。此放大在授权的欧洲专利号EP1309867中被充分地证实和描述，其公开内容通过引用结合到本文中。

通常，放大反应发生在释放剂的溶液中。由于稀释的因素，即释放的荧光素分子在释放剂的反应体积中变得稀释，这导致分析灵敏度较理想值有轻微下降。