[发明专利]一种提高细胞酶活性发酵生产1,3丙二醇的方法

说明书

技术领域

本发明涉及1，3-丙二醇生物催化合成技术领域，具体涉及一种提高细胞酶活性发酵生产1，3丙二醇的方法。

背景技术

1，3-丙二醇是一种重要的化工原料，可作为合成聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的重要单体，以及合成杂环、药物等的中间体，还可作为溶剂用于油墨、印染、涂料、药物、润滑剂、抗冻剂等。

目前，规模工业化生产1，3-丙二醇的方法为化学合成法，主要的生产厂家为Dupont和Shell两家跨国公司，分别以环氧乙烷或丙烯醛为原料生产1，3-丙二醇，用于合成PTT纤维。然而，化学合成的缺点是副产物多，选择性差，操作条件需高温高压，设备投资巨大，原料为不可再生资源，且使用的原料如环氧乙烷或丙烯醛具有一定的危险性。另外，1，3-丙二醇还可以经淀粉、葡萄糖或甘油等生物发酵法得到，生物发酵法具有选择性高，操作条件温和等特点，使用的原料为淀粉、葡萄糖或甘油等可再生资源。近年来，随着石油、煤、天然气等石化资源的日趋紧缺以及地球环境的日益恶化，以生物质工程技术为核心的绿色合成技术和生态材料的发展日益受到人们的重视，因此，用生物发酵法合成1，3-丙二醇是大势所趋。

在用甘油发酵生产1，3-丙二醇的过程中，甘油作为唯一碳源和能源沿着氧化和还原途径发生歧化反应，氧化途径中产物与糖类发酵产物一致，并产生供细胞生长所必需的ATP，能将甘油转化为1，3-PDO的微生物主要包括克雷伯杆菌属、柠檬菌属及梭状芽孢杆菌属等。在甘油转化为1，3-PDO的厌氧发酵途径中，甘油除一部分形成生物量外，其余沿着氧化和还原两条平行路径代谢。在氧化途径中，甘油在依赖于NAD的甘油脱氢酶(GDH)的作用下形成二羟基丙酮(DHA)，磷酸化后进入糖酵解途径，为微生物生长提供ATP和NADH。在还原途径中，甘油在以维生素B₁₂为铺酶的甘油脱水酶(GDHt)的作用下生成3-羟基丙醛(3-HPA)，然后在依赖于NADH的1，3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)的作用下形成产物1，3-PDO。在1，3-PDO的形成过程中，GDH、GDHt和PDOR是关键酶，它们的活力与1，3-PDO的产率密切相关。另一部分被丙酮酸甲酸裂解酶催化分解为乙酰CoA和甲酸，而乙酰CoA在经乙酰磷酸形成乙酸。在发酵甘油生产1，3-丙二醇的过程中，乳酸和乙酸是两种最主要的副产物，它们的形成不但消耗有效的碳源，使得甘油转化率降低，更由于它们在发酵液中的积累会对细胞的正常生理代谢形成毒害作用，获得产酸突变株对于提高1，3-PDO的发酵产量也将有一定的积极意义。

目前生物合成生产1，3-丙二醇存在产物浓度低、甘油转化率低以及生产周期长生产强度低等问题，因而缺失市场竞争力。要提高1，3丙二醇的转化率，减少副产物的生成，分别采取不同的发酵调控策略：添加铺因子，双底物发酵等发酵工艺，提高1，3丙二醇的转化率、产量、生产强度、降低发酵成本。

现有的方法有：两段双底物发酵生产1，3丙二醇(过程工程学报.20033：269-273)；采用外源添加维生素C或维生素E等还原剂的方法促进1，3丙二醇生产(李春等，外源添加还原剂促进菌体合成1，3丙二醇的方法，专利公开号：CN1446919A)；底物流加策略对发酵法生产1，3丙二醇的影响(食品与发酵工业.2004.30：398-400)；克雷伯杆菌生产1，3丙二醇关键酶发酵条件研究(高校化学工程学报.2004.18：621-627)；一种改变细胞膜通透性有效生产1，3-丙二醇的方法(吴敏等，专利公开号：CN101230362A)。

目前已有的发酵工艺都存在产物、副产物对细胞生长和细胞酶活性的抑制，导致整个发酵过程中产物浓度低，生产周期较长，生产强度偏低。

本发明通过代谢和酶学分析发现，影响1，3-丙二醇合成的关键因素为关键酶活性的大小。实验结果表明，在发酵过程中添加氨基酸盐和渗透剂可以有效的提高关键酶的活性，从而使得1，3-丙二醇浓度、生产强度、转化率显著提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高酶活性发酵生产1，3-丙二醇的方法。通过添加氨基酸盐和渗透剂的方法以提高酶活性，一方面提高了酶催化的活性构象和维持细胞稳定生长，另一方面可掩蔽亲核剂，减少副产物的产生，同时消除了产物与副产物的抑制作用，从而有利于1，3-丙二醇产出。

为实现上述目的本发明采用如下技术方案：

一种提高酶活性发酵生产1，3-丙二醇的方法，其特征在于：具体包括如下步骤：

(1)菌种的选择：选择克雷伯杆菌作为菌种，先接种到LB培养机进行斜面培养；