[发明专利]一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种通过PCR技术改造工程质粒且对改造后质粒的宿主菌采用Red系统进行介导来提高L-苯丙氨酸产酸率的方法。

【背景技术】

L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)简称L-Phe，为白色结晶粉末，是人体和动物不能在体内自行合成的必须的氨基酸之一，广泛应用于食品、饲料、医药和化妆品等领域，尤其是低热量、高甜度的二肽甜味剂阿斯巴甜(Aspartame)应用日益广泛，作为合成阿斯巴甜两种原料之一的L-苯丙氨酸的市场需求量迅速增加。另外L-苯丙氨酸也是抗肿瘤药物和氨基酸输液制剂的必需原料，随着其在医药领域的不断开发，需求量也不断增加。因此，对L-苯丙氨酸生物合成途径的研究、L-苯丙氨酸产生菌的改良和对其工业化生产的研究越来越受到人们的重视。

国内外L-Phe的生产方法主要有水解抽提法、化学合成法、酶法和发酵法等。由于天然蛋白中L-苯丙氨酸含量较低，水解抽提法很少使用；化学合成法的工艺复杂，成本较高，在国外基本上被酶法和发酵法取代。但由于底物和酶的价格较高且来源有限，酶法应用也受到限制；由于微生物直接发酵法可利用廉价易得的原料，又可在常温常压下进行，是目前国内外生产L-Phe的主流方法，具有较大的竞争优势。其中大肠杆菌以其繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传背景清楚等特点被广泛改造为适应于外源基因表达的安全的基因工程受体生物。但是由于L-Phe等终产物对野生菌株体内的芳香族氨基酸合成代谢途径上的关键酶有着强烈的反馈抑制作用，使其细胞不能大量蓄积苯丙氨酸。同时，多条竞争支路也相对分流了L-Phe的能量流向，从而使得L-Phe的收率有限。因此若要进行实际发酵生产，就必须改造野生菌株，解除支路代谢调控，使其目的代谢终产物能过量蓄积。

传统的菌株选育是从自然界中高通量筛选产酸能强的菌株，但是该方法获得的氨基酸种类和产量有限，后来在确立突变技术和阐明氨基酸合成系统调节机制的基础上发展为营养缺陷变异株的选育。利用常规诱变育种的方法，其盲目性大，工作量繁重，而且不能增加基因的拷贝数量，且突变株一般都携带多种营养缺陷，使进一步提高产量受到限制。

近年来，随着分子生物学研究的不断深入，有机体越来越多的生物合成途径被人们所认识，一些微生物基因组全序列的测定及多基因之间的协同作用和代谢网络的多方面性研究、代谢工程和生物信息学研究的兴起，基因、宿主有机体、载体系统和分子生物学工具的发展，通过代谢途径的修饰不仅可以提高细胞己有的化学物质产量或产生宿主细胞本身不能合成的新物质，而且可以扩展细胞的底物使用范围，提高一些有重要经济价值的初级代谢产物和次生代谢产物。其中此类方法中以提高氨基酸的产量最具有成功的典范。

大肠杆菌直接发酵法合成L-苯丙氨酸，生物合成途径分为共同途径和分支途径，共同途径为分支途径提供前体物质。以葡萄糖为起始物经赤藓糖-4-磷酸(Erythrose-4-phosphate，E4P，五碳糖磷酸途径的中间产物)和糖酵解过程的中间产物——磷酸烯醇式丙酮酸(Phophoenol pyruvate，PEP)二者缩合形成一个七碳酮糖开链磷酸化合物，称为3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(3-deoxy-α-arobinoheptul osonate-7-phosphate，DAHP)。这是芳香族氨基酸生物合成的共同代谢途径，也是决定其产率和产量的关键步骤。因此，在大肠杆菌L-苯丙氨酸生物合成中，DAHP是L-苯丙氨酸生物合成过程中第一个也是最重要的代谢中间物，能否把中心代谢流有效地导向DAHP的合成是决定芳L-苯丙氨酸生物合成产量高低的决定因素。催化这一关键反应的酶称之为脱氧阿拉伯糖型庚酮糖磷酸合酶(DS)，是分别由aroF、aroG和aroH三个基因编码的三个同功酶，分别受酩氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的反馈抑制，同时DAHP合成酶还受到苯丙氨酸和酪氨酸的协同抑制。

共同途径之后，分支酸是芳香族氨基酸合成途径的分支点，在分支酸以后又分为两条途径，其中一条形成苯丙氨酸和酪氨酸，另一条形成色氨酸。

分支酸在分支酸变位酶作用下，转变为预苯酸，经脱水、脱梭后形成苯丙酮酸，后者在转氨酶作用下，与谷氨酸进行转氨形成苯丙氨酸。分支酸途径是人们较早对L-苯丙氨酸改良进行遗传操作的重要环节。分支酸变位酶(CM)是与预苯酸脱水酶(PD)形成的双功能酶，其活性态是两个pheA基因编码的大小为43000D的亚基构成的同源二聚体；CM/PD酶在Phe浓度较高时形成二聚体和四聚体的混合物，使酶活性降低或完全丧失，所以它受产物Phe的反馈抑制，Tyr对此酶也有协同抑制。