[发明专利]一种提高可卡因检测灵敏度的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用三段核酸探针提高可卡因检测灵敏度的方法，属于纳米生物技术领域。

背景技术

以可卡因为代表的毒品检测技术近些年来取得了很大的进展，尤其是利用核酸适配体进行检测的技术引起了极大的关注。核酸适配体是从～10¹⁴的随机序列的DNA或RNA库中通过指数富集的系统分子进化方法(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment，简称SELEX)筛选出来的，能够特异性地与靶标分子结合，从而特异性地识别靶标分子(Ellington AD，Szostak JW(1990)Nature 346：818-822.Tuerk C，Gold L(1990)Science 249：505-510.)。核酸适配体可以用于包括蛋白质、小分子、重金属离子、细胞和病毒等的各种各样的生物分子的检测，具有极大的应用前景。

目前利用核酸适配体进行可卡因检测的方法，主要是使用一段核酸适配体(M.N.Stojanovic，et.al，J.Am.Chem.Soc.2001，123，4928-4931.；B.R.Baker，et.al，J.Am.Chem.Soc.2006，128，3138-3139)，或使用将一段分开成两段的核酸适配体进行可卡因的检测(Stojanovic，M.N.；de Prada，P.；Landry，D.W.J.Am.Chem.Soc.2000，122，11547-11548.；J.Zhang，et.al，small 2008，4，No.8，1196-1200；R.Freeman，et.al，J.Am.Chem.Soc.2009，131，5028-5029；Analyst，2009，134，653-656；X.Zhou，et.al.，J.Am.Chem.Soc.2009，131，6944-6945)。在具体的检测方法上主要是利用荧光淬灭、酶催化的颜色反应、电化学或纳米金颜色反应进行可卡因的检测。这些方法的检测灵敏度在0.1μM-500μM的范围内。

以纳米金颜色检测为例，在现有利用纳米金的检测技术中，应用最多的是利用纳米金表面等离子共振的光学性能，独立存在的纳米金是红色的，而聚集在一起的纳米金是蓝灰色或紫色的。也就是说，现有技术在进行生物检测和环境检测时必须直接或间接地引起纳米金聚集，或者将聚集的纳米金重新分散，从而引起纳米金颜色的变化，可见光的吸收波长产生高达300nm的移动。这种颜色变化可以直接用肉眼观察，无需任何复杂设备，也可以使用光谱仪进行定量检测。

现有的引起纳米金的聚集的方法可以分为两大类。第一类方法是检测物作为交联剂将纳米颗粒联结在一起，从而引起聚集。比如DNA诱导的通过颗粒间交联造成的聚集方法。这类方法需要将单链DNA，DNA酶，RNA酶或核酸适配体连接到纳米材料的表面。实验步骤相对繁琐，DNA，DNA酶，RNA酶或核酸适配体的用量大。第二类方法是非交联的纳米颗粒聚集方法，这种方法利用纳米颗粒在加入检测物后稳定性的降低。这种稳定性的降低是由于纳米颗粒表面用于提高纳米金稳定性的DNA分子或ATP的破坏，取代或消耗；或者由于与未修饰纳米颗粒相互作用的溶液中可以稳定纳米颗粒的ATP或单链DNA的减少。这类方法大多使用未修饰的纳米金颗粒。

使用未修饰纳米金进行检测的方法是目前所有检测技术中最为简单、便宜和快速的检测技术，目前该方法已经用于包括对DNA、小分子和重金属离子在内的多类生物分子的检测。这类方法多是基于双链DNA结构比单链DNA稳定纳米金差这一现象。所报道的使用未修饰纳米金对可卡因进行检测的方法就是利用两段核酸适配体探针，在可卡因存在的时候与可卡因一起形成具有双链DNA结构的超分子结构，该结构比单链的核酸探针稳定纳米金的能力差，因此可以用于可卡因的检测。

以上所述各种采用一段或两段核酸适配体进行可卡因检测的方法存在着以下不足：

1)使用一段核酸适配体检测可卡因的检测方法是利用适配体与可卡因结合引起适配体的构相变化，首先通过SELEX技术所筛选出来的适配体大约只有1％能够在与靶标结合的时候有构相变化，这就极大地限制了上述方法对其它靶标检测的通用性；适配体的长度通常30个碱基左右(比如可卡因的适配体和Adenosine的适配体)，甚至更长，这样自身形成二级结构形成二倍体、多倍体的机会就会大幅增加，从而减低检测灵敏度，尤其在结合酶反应进行的可卡因检测，会造成很高的背景信号。