[发明专利]提高假单胞菌生产D-甘露糖异构酶产量的方法

说明书

优化发酵培养基提高假单胞菌CGMCC No.2120生产D-甘露糖异构酶产量的方法，属于微生物发酵技术领域。 

背景技术

D-甘露糖异构酶(D-甘露糖酮醇-异构酶，EC5.3.1.7)催化可逆的D-甘露糖与D-果糖的异构化反应。D-甘露糖是许多多糖和糖蛋白的成分，可用于合成药物，它还能抑制鼠伤寒沙门氏菌生长，可以用作家禽饲料添加剂防止细菌污染。甘露糖及其衍生物被广泛应用于食品工业、医药等行业。尽管D-甘露糖的需求量逐渐增加，市场上昂贵的价格使之不能广泛的应用。因此，用甘露糖异构酶将蔗糖，D-果糖转化为一种昂贵的D-甘露糖将会有利于降低产品成本。 

目前，关于D-甘露糖异构酶的研究多见于外国报道，国内尚未见报道。1993年，Takasaki等[Takasaki Y，Hinoki K，Kataoka Y，Fukuyama S，NishimuraN，Hayashi S，Imada K(1993)Enzymatic production of D-mannose from D-fructoseby mannose isomerase.J.Ferment.Bioeng.76：237～239]利用新近从土壤中分离到的假单胞菌MI产生耐热甘露糖异构酶。2003年，Jun Hirose，Takasaki等[JunHirose，Yuka Kinoshita，Seijiro Fukuyama，Sachio Hayashi，Haruhiko YokoiYoshiyuki & Takasaki(2003)：Continuous isomerization of D-fructose to D-mannoseby immobilized Agrobacterium radiobacter.cells Biotechnology Letters.25：349～352.]用固定化放射土壤杆菌细胞将D-果糖连续异构化成D-甘露糖。Ann Hey-Ferguson等[ANNHEY FERGUSON，ALAND.ELBEIN(1969).Purification of aD-Mannose Isomerase from Mycobacterium smegmatis.JOURNAL OFBACTERIOLOGY.101：777～780.]使耻垢分枝杆菌M.Smegmatis细胞在甘露糖做唯一碳源的培养基上生长，其细胞产出甘露糖异构酶。但是在这些文献中都没有提到过发酵培养基及发酵条件的优化。 

发明内容

本发明的目的是提出一种优化发酵培养基提高假单胞菌CGMCC No.2120生产D-甘露糖异构酶产量的方法，首次报道了采用单因子实验、Plackett-Burman设计、最陡爬坡路径实验、响应面中心组合设计等统计学方法对假单胞菌(Pseudomonas sp.)CGMCC No.2120产D-甘露糖异构酶发酵培养基进行优化。 

本发明的技术方案：一株产D-甘露糖异构酶的菌株，其分类命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)JN18，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏编号为CGMCC No.2120。 

一种优化发酵培养基提高假单胞菌CGMCC No.2120生产D-甘露糖异构酶产量的方法： 

菌种：假单胞菌(Pseudomonas sp.)CGMCC No.2120； 

培养基以g/L计为： 

斜面培养基：牛肉膏3，蛋白胨5，琼脂15，pH7.0； 

种子培养基：葡萄糖1，酵母膏3，pH7.0； 

初始发酵培养基：葡萄糖5，酵母膏3，K₂HPO₄2，pH7.0； 

优化后的产酶发酵培养基：果糖15-16(最优为15.26)，牛肉膏20，酵母膏2，K₂HPO₄2，MgSO₄·7H₂O0.5，NaCl0.5，Tween-801.5-1.6(最优为1.54)； 

培养方法 

种子培养：取生长良好的斜面菌种5环，接种于装有种子培养基床培养24h。 

发酵培养：吸取种子发酵液至装有适当发酵培养基的250mL三角瓶中，接种量为4％体积分数，30℃振荡培养48h。