[发明专利]一种提高免疫检测灵敏度的方法

说明书

技术领域

本发明涉及体外检测技术领域，具体地涉及一种提高免疫分析检测灵敏度的方法。

背景技术

免疫分析法(immunoassay，IA)是基于抗原和抗体特征性反应的一种技术。由于免疫分析试剂在免疫反应中所体现出的独特的选择性和极低的检测限，使这种分析手段在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用。

生物素(biotin)一亲合素(avidin)是免疫分析技术中的重要工具，主要是因为其有下述几个特点：

①亲和素对生物素的亲和力极高，为抗原抗体反应的百万倍，具高度特异性和稳定性。

②生物素分子小，结构简单，极易与抗体、核酸、多糖及多种酶等生物大分子以共价键稳定结合，同时对结合物的原始生物活性无不良影响。

③亲和素性质极为稳定，每分子可结合4个生物素衍生物，其作为生物素化分子与信号物之间的桥，起到信号放大作用，从而提高检测的灵敏度。

由生物素-亲和素反应建立信号放大系统，一般有两种方法：一是用生物素标记抗体，与固相抗原结合后，再加入亲和素-酶结合物，从而使测定反应放大；二是使用生物素-抗体、游离亲和素和生物素-酶结合物三种试剂，于固相抗原中加入试剂的顺序为生物素-抗体、亲和素和生物素-酶。

上述方法之所以可行，在于亲和素对生物素的4价结合能力，上述多步模式也可通过预先制成可溶的亲和素-生物素化酶复合物而得到简化，亦即所谓的ABC(avidin-biotin-complex)方法(参见US专利4684609)，这种生物素-亲和素放大系统可使常规的酶免疫分析法(EIA)或荧光免疫分析法(fluorescence immunoassay，FIA)的检测灵敏度提高2～100倍。然而，目前现有的这些检测方法还不能令人满意地满足临床上检测人血清中极低含量生物分子的需求。

因此，本领域迫切需要开发进一步提高免疫检测灵敏度的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种进一步提高免疫检测灵敏度的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种生物素-亲和素的复合物，所述复合物包括：

(a)固相载体；

(b)根序列，所述的根序列是固定于所述固相载体表面上的寡核苷酸单链；

(c)引发序列，所述的引发序列是互补结合于所述根序列的、并且在一端标记有生物素的寡核苷酸单链；

(d)第n级亲和素，其中n为1-20的正整数；并且当n为1时，则第1级亲和素结合于所述引发序列上的生物素；和

(e)生长序列，所述的生长序列是两端标记有生物素的寡核苷酸单链，所述生长序列中位于一端的生物素与第n级亲和素结合，而位于另一端的生物素与第n+1级亲和素结合或处于未结合状态，其中n为1-20的正整数。

在另一优选例中，所述的固相载体是微球；更佳地，所述的固相载体为磁性微球，例如微米级微球、纳米颗粒、或荧光微球。

在另一优选例中，n为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，或19。

在另一优选例中，所述的根序列的长度为20-60个碱基，更佳地为25-50个碱基。

在另一优选例中，所述的引发序列的长度为10-50个碱基，更佳地为15-40个碱基。

在另一优选例中，所述引发序列与根序列的互补结合区的长度为20-40bp，更佳地为20-30bp。

在另一优选例中，所述的生长序列的长度为8-30个碱基，更佳地为10-20个碱基。

在另一优选例中，所述的生长序列是长度为8-20个碱基的polyT。

在本发明第二方面，提供了一种生物素-亲和素的复合物，所述复合物包括：

(i)引发序列，所述的引发序列是在一端标记有生物素的寡核苷酸单链；

(ii)第n级亲和素，其中n为1-20的正整数；并且当n为1时，则第1级亲和素结合于所述引发序列上的生物素；和

(iii)生长序列，所述的生长序列是两端标记有生物素的寡核苷酸单链，所述生长序列中位于一端的生物素与第n级亲和素结合，而位于另一端的生物素与第n+1级亲和素结合或处于未结合状态，其中n为1-20的正整数。

在本发明的第三方面，提供了一种免疫检测分析方法，在本发明第一或第二方面中所述的生物素-亲和素的复合物存在下进行免疫分析检测。

在本发明的第四方面，提供了一种在本发明第一或第二方面中所述的生物素-亲和素的复合物的用途，它用于制备提高免疫检测灵敏度的灵敏度增强剂。