[发明专利]一种偶数200bp梯度DNA分子量标准及其快速制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学试剂制备和基因工程应用领域，具体来说就是通过基因工程手段构建超级质粒，通过大肠杆菌发酵和限制性内切酶酶切的方法制备一种偶数200bp梯度DNA分子量标准。

背景技术

在DNA合成及各种方式的基因操作过程中，需要对合成的或进行操作的DNA分子大小变化进行监测，常用的方法是通过将待测DNA分子与一种已知分子量的DNA混合标准物(分子量标准、DNA marker)同时进行电泳，通过比较待测DNA分子与DNA分子标准在电泳过程中的迁移距离来判断DNA样品分子的大小。因此，需要制备一些已知分子量的标准DNA混合物。

现有技术中制备标准DNA的方法已有多种方法：

化学合成法：通过化学反应的方法将4种不同的脱氧核糖核苦酸：腺嘌呤(dATP)，鸟嘌呤(dGTP)，胞嘧啶dCTP)，胸腺嘧啶(dTTP)结合在一起，合成目标大小的DNA片段。该方法操作十分繁琐，效率极低，合成的DNA长度受到严重的限制，一般可合成DNA的长度不超过400bp，大分子量的DNA片段无法直接用化学合成法来合成，成本太高，因而不适用DNA分子量的常规制备。

片段连接法：先用PCR或者合成的方法获得小分子量的DNA分子(如100bp)，再用酶促连接反应将小分子DNA一个一个顺序连接起来，形成不同大小的DNA分子(100bp、200bp、300bp、400bp、…)。该方法理论上讲可以制备各种大小的DNA分子，但操作却十分繁琐，可再现性差，无法实现大规模制备。

聚合酶链反应法：DNA聚合酶链反应已广泛用于基因克隆和DNA片般的制备。目前国内外已被广泛用来制备DNA分子量标准物。但是该方法费时费力，是一种劳动密集型的生产方式，其生产能力有限。

酶切法：用一种或两种限制性内切酶组合对噬菌体DNA或人工设计的质粒进行切割，产生不同大小的DNA片段，以作为DNA分子量标准。该方法的优点是容易大量制备，产率高。但该方法的缺点也很突出：酶切产生的DNA片段大小受到所用的限制性酶种类的限制，其制约因素是人工构建质粒的设计水平。

长期以来，分子生物学试剂与基因工程应用领域，需要一种设计水平高、制备方便的偶数200bp梯度DNA分子量标准，以及该偶数200bp梯度DNA分子量标准快速生产方法(生产工艺)。

发明内容

经过长期的实验室研究，本发明恰恰满足了上述需求，其目的在于：提供一种偶数200bp梯度DNA分子量标准。

本发明的进一步目的在于：提供一种快速、大量地制备一种偶数200bp梯度DNA分子量标准的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

通过PCR的方法以Lambda DNA为模板分别扩增了400bp、600bp、800bp、1000bp、1400bp、2000bp几条片段，其中1400bp和1000bp通过pfu DNA聚合酶进行扩增，而400bp-A、400bp-B、600bp、800bp分别用Taq DNA聚合酶进行扩增。然后利用Taq DNA聚合酶的加尾活性对1400bp和1000bp两条片段加T。再利用A/T互补的原理在离心管中建立连接体系，利用T4连接酶使600bp、800bp、1000bp连接成一个600-1000-800的单元，同样400bp-A、400bp-B和1400bp连接成400A-1400-400B的单元。然后通过T/A克隆试剂盒，把上述两个单元分别克隆到T载体中形成中间载体T681和T4144。

通过Pst I酶切将400A-1400-400B单元从T4144中切出来，并利用核酸纯化回收试剂盒进行回收和纯化。同时T681载体也被Pst I酶切完全酶切，并利用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)进行载体脱磷处理，以防止载体自连。建立合适的连接体系，把400-1400-400单元连接进脱磷处理的T681载体所得中间载体命名为T6814144。通过与上述过程相近的技术路线，利用PCR方法从Lambda DNA中扩增获得一个2000bp的片段，并克隆到T载体中，然后用内切酶Sph I再切出来，连入同样Sph I酶切和CIAP脱磷处理的T6814144，获得质粒pYE9600。