[发明专利]一种偶数200bp梯度DNA分子量标准及其快速制备方法

权利要求书

1.一种偶数200bp梯度DNA分子量标准，其特征是由7条DNA带组成的限制性内切酶酶切混合物，长度分别为：400bp、600bp、800bp、1000bp、1400bp、2000bp、3000bp；各条DNA带的浓度(质量)之间具有一定的比列关系(2∶3∶4∶5∶7∶10∶15)。

2.根据权利要求1所述的一种偶数200bp梯度DNA分子量标准的快速制备方法，7条DNA带是以质粒pYE9600酶切对象，通过大肠杆菌发酵和碱裂解法提取目标质粒pYE9600，经过纯化，用限制性内切酶EcoR I进行酶切消化，从而释放其中所含的200bp系列片段，其特征在于：

①取-20℃冷冻保存的pYE9600质粒2-5微升通过热激转化的方法将其转入大肠杆菌DH5α或JM109中，涂布于含有氨苄青霉素的平板上，倒置于37℃恒温箱内过夜培养，第二天挑单菌落，用含有氨苄青霉素的LB液体培养基(5ml)培养至OD600＝0.8，转接于100ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，摇床剧烈震荡培养3-5小时，至OD600＝0.6时，继续以1∶100的比例转接于已37℃预热的含有氨苄青霉素的LB液体培养基(1000ml)中培养12-16小时；

②目标质粒pYE9600的大量制备及纯化，其过程包括以下步骤：

(1)于250ml离心瓶中4100-6000rpm常温或4℃收菌，离心时间为3-10分钟，获得菌体沉淀；用20ml的溶液I重悬菌体沉淀；并将之转入600ml的矿泉水瓶中；

(2)分别加入40ml新配制的溶液II，拧好盖子，轻轻颠倒数次，使内容物彻底混匀，室温下放置10-15分钟；

(3)分别加入30ml冰预冷的溶液III，拧好盖子，轻轻地但完全地颠倒、震荡混匀几次(此时不应再有分离的两个液相)；将矿泉水瓶在冰上放10-20分钟；

(4)将矿泉水瓶中的内容物转入离心瓶中，平衡后离心；

(5)6000rpm离心20分钟，将上清轻轻转入量筒中，弃去离心瓶中的沉淀；

(6)加30ml氯仿抽提；

(7)转入分液漏斗，静置5分钟，待分相后，分别收集下层的有机相(氯仿)和上层的水相；

(8)将水相10,000rpm离心10分钟；

(9)合并所有水相(加入10ul的RNase，室温静置10分钟)，量其体积，加入0.7倍体积的异丙醇，并充分混匀，室温下放置10-20分钟；

(10)室温下8000rpm离心15分钟，以回收核酸沉淀；

(11)小心弃去上清，将离心管敞开盖，倒置于纸巾上以除去残余的上清；

(12)室温下用5ml 70％的乙醇刷洗管底及管壁，小心的倒掉乙醇(注意防止沉淀物的倒出)，并将离心管开口倒置于纸巾上使剩余的乙醇挥发掉(15-20分钟)；

(13)5ml TE(pH8.0)溶解湿润的核酸沉淀；

(14)溶解后得到的质粒溶液用等体积的酚-氯仿抽提3遍，以充分去除蛋白质，获得澄清的液体；

③利用所获得的pYE9600质粒建立酶切反应体系，其中反应缓冲液的体积为反应总体积的1/10；加入适量的内切酶，充分混匀后于37℃水浴保温20-50个小时；之后将琼脂糖凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液(TAE)，使凝胶浸于液面下约3mm，将部分酶解产物取出并进行梯度稀释，加入适量的凝胶上样缓冲液(loading buffer)并混合，用移液枪将之加入凝胶孔中，以5V/cm的电压进行电泳，使核酸分子向阴极泳动，当溴酚兰泳动到凝胶的三分之二处时停止电泳，在紫外透射仪上观察酶切产物的纯度及产量；

④所得的偶数200bp梯度DNA分子量标准的纯化：用酚∶氯仿为1∶1的混合溶剂抽提，去除其中的蛋白质(主要是内切酶)成份，一般经过2-3次的抽提即可达到满意的效果；通过向体系中加入适量的TE缓冲液，将3000bp的DNA条带定量为150ng，其他条带的量依次为(从大到小)100ng、70ng、50ng、40ng、30ng、20ng。