[发明专利]一种提高DNA质量的土壤样品总DNA提取方法

权利要求书

1.一种提高DNA质量的土壤样品总DNA提取方法，其特征在于：

1)向0.5-5.0g提取样品中加入1.0-5.5ml DNA提取缓冲液，再加入0.3-1.0g石英砂和5-50μl浓度为的蛋白酶K并混匀，置于漩涡振荡器中震荡10～20min；然后30-40℃水浴1-2小时；其中DNA提取缓冲液为50-150mM Tris-HCl，50-100mM EDTA，50-100mM磷酸盐缓冲液，0.5-2.5MNaCl，质量浓度为0.5-2％十六烷基三甲基溴化铵；

2)将震荡后反应液中加入200-2000μl质量浓度为5-10％的十二烷基磺酸钠漩涡震荡后反复冻融3次，而后放入65℃水浴中温育1-2h，进而在室温条件下6000-10000×g离心10-30min，收集上清液，备用；

3)在上述上清液中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合液，摇匀至乳状，室温条件下6000-10000×g离心10-30min，收集上清液；而后再上清液中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀至乳状，室温条件下6000-10000×g离心10-30min，收集上清液；

4)将上述上清液中加入其0.2-0.3倍体积的醋酸钠和0.8-1.2倍体积冷异丙醇混匀，在4℃放置1-2h，10000-12000×g离心20-30min，收集DNA沉淀，沉淀经乙醇润洗2-3次，而后干燥；

5)向干燥后的DNA沉淀中加入50-100μL TE缓冲液使其溶解，得到DNA粗提液；

6)将上述粗体液中500-1000μL的DNA提取缓冲液，重复步骤3)-5)即可获得较高质量的DNA提取液。

2.按权利要求1所述的提高DNA质量的土壤样品总DNA提取方法，其特征在于：所述步骤1)水浴过程中每隔5-15min将样品上下翻转混匀；所述蛋白酶K浓度为10-20mg/L。

3.按权利要求1所述的提高DNA质量的土壤样品总DNA提取方法，其特征在于：所述经步骤2)离心所得沉淀中加入DNA提取缓冲液100-600μl，SDS溶液40-400μl，漩涡震荡混匀，放入65℃水浴中温育30-60min，室温条件下6000-10000×g离心10-30min，收集上清液，其上清液与步骤2)中获得的上清液混合，备用。

4.按权利要求1所述的提高DNA质量的土壤样品总DNA提取方法，其特征在于：所述步骤2)反复冻融为在-65℃冷冻而后在65℃速融即为一次，同时在-65℃冷冻时间为30-60min，65℃时融化时间为10-20min。

5.按权利要求1所述的提高DNA质量的土壤样品总DNA提取方法，其特征在于：所述TE缓冲液为5-20mM Tris-HCl，pH7.5-8.0，0.5-2mM EDTA，所述DNA提取缓冲液中Tris-HCl pH为7.5-8.0，EDTA pH为7.5-8.0，磷酸盐缓冲液pH为7.5-8.0。

6.按权利要求1所述的提高DNA质量的土壤样品总DNA提取方法，其特征在于：所述步骤3)中苯酚-氯仿-异戊醇按体积分数比为25∶24∶1，氯仿-异戊醇按体积分数比为24∶1。