[发明专利]一种提高DNA质量的土壤样品总DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及土壤微生物学，具体说是一种提高DNA质量的土壤样品总DNA提取方法。

背景技术

许多研究已经表明，在现有的技术水平下，自然生态环境中的绝大部分微生物(＞95％)还无法在实验室被成功培养出来。由于培养基不能满足大多数微生物真实的生境条件，纯培养技术只是选择性地让那些生长比较迅速、适应条件变化快的微生物类群优先得到生长繁殖。通过纯培养技术获得的微生物不能代表环境中真实的微生物群落结构组成。

近20年来，许多基于核酸(或16S rRNA基因序列多样性)的分子生物学、分子生态学技术手段不断得到发展并逐步成熟，为揭示生态系统中微生物的群落结构提供了强有力的技术支持。这些方法主要有：扩增核糖体DNA限制性分析技术(Amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA)、单链构象多态性技术(Single strand conformation polymorphism，SSCP)、(末端)限制片段长度多态性技术((Terminal)Restrictionfragment length polymorphism，T-RFLP)、变性凝胶电泳技术(Denaturinggel electrophoresis，DGE)等。所有这些基于环境样品中微生物基因组DNA的研究手段都需要先从样品中提取足量的DNA，然后通过PCR技术获得某一功能基因片段，再根据不同的研究目的进行深入的分析研究。

不同的DNA提取方法获得的DNA量具有一定的差异，但是基本可以满足后续PCR、克隆、酶切等分析操作。然而，由于环境样品的复杂性，不同的DNA提取方法所获得的DNA质量却差异较大。对于有机质含量较为丰富的土壤样品来说，传统的“机械破壁+酶学作用”提取方法对于土壤中含有的腐殖酸等杂质去除能力有限。而残余的腐殖酸或其它一些杂质对于PCR扩增、酶切、克隆等操作的影响非常大。

发明内容

本发明目的在于提供一种提高DNA质量的土壤样品总DNA提取方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

提取方法：1)向0.5-5.0g提取样品中加入1.0-5.5ml DNA提取缓冲液，再加入0.3-1.0g石英砂和5-50μl浓度为的蛋白酶K并混匀，置于漩涡振荡器中震荡10～20min；然后30-40℃水浴1-2小时；其中DNA提取缓冲液为50-150mM Tris-HCl，50-100mM EDTA，50-100mM磷酸盐缓冲液，0.5-2.5M NaCl，质量浓度为0.5-2％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)；

2)将震荡后反应液中加入200-2000μl质量浓度为5-10％的十二烷基磺酸钠(SDS)漩涡震荡后反复冻融3次，而后放入65℃水浴中温育1-2h，进而在室温条件下6000-10000×g离心10-30min，收集上清液，备用；

3)在上述上清液中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合液，摇匀至乳状，室温条件下6000-10000×g离心10-30min，收集上清液；而后再上清液中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀至乳状，室温条件下6000-10000×g离心10-30min，收集上清液；

4)将上述上清液中加入其0.2-0.3倍体积的醋酸钠和0.8-1.2倍体积冷异丙醇混匀，在4℃放置1-2h，10000-12000×g离心20-30min，收集DNA沉淀，沉淀经乙醇润洗2-3次，而后干燥；

5)向干燥后的DNA沉淀中加入50-100μL TE缓冲液使其溶解，得到DNA粗提液；

6)将上述粗体液中500-1000μL的DNA提取缓冲液，重复步骤3)-5)即可获得较高质量的DNA提取液。