[发明专利]一种提高重组人巨噬细胞抑制因子－1(MIC－1)在毕赤酵母中表达量的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种提高重组人巨噬细胞抑制因子-1(MIC-1)表达量的毕赤酵母工程菌(Pichia pastoris)及其构建方法，属于分子生物学领域。

技术背景：

MIC-1是Bootcov等人1997年研究巨噬细胞相关活性因子时在U937细胞cDNA文库中发现的一个新基因，其编码的蛋白属于TGF-β超家族成员。随着在其他组织和器官中的发现，MIC-1又被命名为PTGF-β、PDF、GDF-15、PLAB、NAG-1等。10年来的研究表明MIC-1在胎儿的生长发育、巨噬细胞参与的炎症反应、肿瘤的发生发展进程以及急性损伤等过程中均发挥不同的作用。目前研究发现，MIC-1可能作为新的肿瘤标志物和流产预警指标，其在诊断学中的应用价值越来越受到重视。

MIC-1作为TGF-β超家族成员，其体外表达需要真核细胞表达系统。现有技术是在CHO细胞和毕赤酵母真核细胞表达系统中表达野生型重组MIC-1蛋白，但CHO细胞表达系统成本高，产量低；而在相对优越的毕赤酵母中其表达量也仅为3～8mg/L，难以满足大量生产的需求。为克服现有技术存在之不足，设计寻找一种以毕赤酵母(Pichia pastoris)为宿主高效表达人巨噬细胞抑制因子的新技术方法，具有一定的理论意义和十分重要的应用价值。

发明内容：

本发明的目的是提供一种提高用毕赤酵母(Pichia pastoris)工程菌分泌表达人巨噬细胞抑制因子-1表达量的方法，以期利用该工程菌大规模地生产人巨噬细胞抑制因子-1。

本发明是利用毕赤酵母真核表达系统来生产MIC-1，其表达载体为pPIC9K质粒，其表达产物蛋白可形成二聚体成熟蛋白结构并分泌到细胞外。

本发明在MIC-1野生型基因的基础上，将其5’端的7个毕赤酵母非偏好密码子改造为其同义优越密码子，从而大大提高MIC-1在毕赤酵母中的表达。MIC-1毕赤酵母菌株经鉴定MIC-1产量可达到50mg/L，远高于前述国外文献报道的利用毕赤酵母生产MIC-1的表达量。

本发明目的通过以下技术方案实现：

1)获得及优化MIC-1基因片段

根据人巨噬细胞抑制因子-1基因序列特点和毕赤酵母表达载体pPIC9K质粒多克隆位点的序列特点，设计上游引物和下游引物，通过RT-PCR方法，从人胎盘组织中扩增MIC-1野生型基因片段并通过PCR方法对其进行优化，最终获得优化密码子的突变型MIC-1基因片段。

2)构建毕赤酵母表达载体pPIC9K-MIC-1：

将获得的优化密码子的突变型MIC-1基因片段用Xho I和Not I双酶切，直接插入到pPIC9质粒中，得到表达载体pPIC9-MIC-1；将表达载体pPIC9-MIC-1用BamH I和Not I双酶切，pPIC9K质粒用BamHI和Not I双酶切后回收大片段，含MIC-1基因的片段和pPIC9K质粒酶切大片段通过T4DNA连接酶连接、转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性转化子，从而完成毕赤酵母表达载体pPIC9K-MIC-1的构建。

3)构建毕赤酵母MIC-1生产菌株：

重组质粒pPIC9K-MIC-1用Sac I酶切使其线性化，PEG1000法转化毕赤酵母GS115感受态细胞，在MD平板上培养2～3天，挑取His+阳性转化子，获得毕赤酵母MIC-1生产菌株。

4)筛选毕赤酵母MIC-1高表达菌株：

用G41 8抗性浓度递增法筛选多拷贝克隆，并通过PCR、Western blot等方法对转化子进行检测，确证MIC-1基因已整合到毕赤酵母基因组并正确表达。将各转化子在不含甲醇的培养基BMGY中28～30℃培养至OD₆₀₀＝2～6，无菌条件离心后在含0.5％甲醇的BMMY诱导培养基中培养，在诱导过程中，每24小时补充甲醇使其终浓度维持在3％附近，培养72小时后离心收集各转化子的上清培养基，用Tricine SDS-PAGE蛋白质电泳、密度扫描法和BCA蛋白定量法检测转化子MIC-1的分泌表达产量，筛选毕赤酵母MIC-1高表达菌株。

克隆MIC-1基因片段时所采用的上游引物和下游引物分别为：

上游引物1：AGTCCTCGAGAAAAGAgcgcgcaacggggac

上游引物2：ggcccgggcgttgttgtcgtctgcacacggtcagagcttcgctggaagacctgggctgg

上游引物3：tatctcgagaaaagagctagaaacggggaccactgtccactcgggcccgggcgttgttg