[发明专利]一种提高重组人巨噬细胞抑制因子－1(MIC－1)在毕赤酵母中表达量的方法

权利要求书

1.一种提高重组人巨噬细胞抑制因子-1在毕赤酵母中的表达量的方法，其特征在于人巨噬细胞抑制因子-1基因序列如下：

GCT AGA AAC GGG GAC CAC TGT CCA CTC GGG CCC GGG CGT TGT TGT CGT CTG CAC ACG GTC

AGA GCT TCG CTG GAA GAC CTG GGC TGG GCC GAT TGG GTG CTG TCG CCA CGG GAG GTG

CAA GTG ACC ATG TGC ATC GGC GCG TGC CCG AGC CAG TTC CGG GCG GCA AAC ATG CAC

GCG CAG ATC AAG ACG AGC CTG CAC CGC CTG AAG CCC GAC ACG GTG CCA GCG CCC TGC

TGC GTG CCC GCC AGC TAC AAT CCC ATG GTG CTC ATT CAA AAG ACC GAC ACC GGG GTG TCG

CTC CAG ACC TAT GAT GAC TTG TTA GCC AAA GAC TGC CAC TGC ATA TGA

克隆插入带有甲醇调节型启动子(AOX1)的载体pPIC9K中，获得表达载体pPIC9K-MIC-1，采用PEG1000法转化GS115毕赤酵母菌，用G418抗性浓度递增法筛选多拷贝克隆，得到高表达毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-MIC-1。

2.根据权利要求1所述的制备人巨噬细胞抑制因子-1方法，其特征在于表达载体pPIC9K-MIC-1含有权利要求1所述的人巨噬细胞抑制因子-1基因序列。

3.根据权利要求1所述的制备人巨噬细胞抑制因子-1方法，其特征在于含有权利要求1所述的人巨噬细胞抑制因子-1基因序列插入载体pPIC9K中，而获得的表达载体pPIC9K-MIC-1。

4.根据权利要求1所述的制备人巨噬细胞抑制因子-1方法，其特征在于含有权利要求1所述的表达载体pPIC9K-MIC-1，PEG1000法转化的GS115毕赤酵母菌所获得的高表达毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-MIC-1。

5.根据权利要求1所述制备人巨噬细胞抑制因子-1的方法，其特征在于：

A、根据人巨噬细胞抑制因子-1基因序列特点和毕赤酵母表达载体pPIC9K质粒多克隆位点的序列特点，设计3个上游引物和1个下游引物，采用RT-PCR方法，依次以上游引物1、2及3和下游引物进行PCR扩增出同权利要求1所述完全一样的人巨噬细胞抑制因子-1基因序列。克隆MIC-1基因片段时所采用的上游引物和下游引物分别为：

上游引物1：AGTCCTCGAGAAAAGAGCGCGCAACGGGGAC

上游引物2：GGCCCGGGCGTTGTTGTCGTCTGCACACGGTCAGAGCTTCGCTGGAAGACCTGGGCTGG

上游引物3：TATCTCGAGAAAAGAGCTAGAAACGGGGACCACTGTCCACTCGGGCCCGGGCGTTGTTG

下游引物：TATAGCGGCCGCTTATCATATGCAGTGGCAGTCTTTGGC

B、将上述人MIC-1基因序列克隆导入表达载体pPIC9K质粒中获得表达载体pPIC9K-MIC-1。线性化后PEG1000法转化GS115毕赤酵母菌，用G418抗性浓度递增法筛选多拷贝克隆得高表达毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-MIC-1。

C、上述所得高表达的毕赤酵母菌株在不含甲醇的培养基BMGY中28～30℃培养至OD₆₀₀＝2～6，再在含0.5％甲醇的BMMY诱导培养基中培养，每24小时补充甲醇使其终浓度维持在0.5～3％培养36～96小时后离心收集各转化子的上清培养基，用Tricine SDS-PAGE蛋白质电泳、密度扫描法和BCA蛋白定量法检测转化子的人MIC-1的分泌表达产量。