[发明专利]通过提高的分泌来生产多肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及重组DNA技术。具体地，本发明涉及SEC61多肽，其具有针对酵母SEC61所描述的蛋白转运活性(Saccharomyces基因组数据库-SGD：http：//www.yeastgenome.org/)，涉及编码这些多肽的核酸序列，以及其在制备适合用于生产目标多肽的宿主细胞中的用途。

发明背景

蛋白向培养基的分泌涉及蛋白转运经过多个膜闭合的区室，这构成了分泌途径。首先，蛋白被转移到内质网ER内腔。蛋白质在膜囊中从那儿转运到Golgi复合体，并从Golgi复合体转运到质膜。分泌过程涉及多个步骤，其中，含有被分泌蛋白的囊从供体膜上被剪下来，定位到受体膜并与之融合。在这些步骤中的每一个，需要若干种不同蛋白的功能。

已经进行了若干尝试，企图提高有丝真菌中蛋白的分泌。用于提高异源蛋白分泌的常用手段是使用信号序列(见，例如，EP 0215 594)。针对被分泌蛋白的随机诱变和筛选(Smith et al.，1985；Sakai et al.，1988；Shusteret al.，1989；Suzuki et al.，1989；Sleep et al.，1991；Lamsa and Bloebaum，1990；Dunn-Coleman et al.，1991和US2002/0068325A1)或外源蛋白与高效分泌的内源蛋白的融合(Ward et al.，1990；Harkki et al.，1989；Nyyssonen et al1993；Nyyssonen et al.，1992)已被广泛用于酵母和有丝真菌，以使异源蛋白的分泌更为高效。这两种方法都有使用局限。通过随机诱变和筛选分离出的突变体基本都是排他性地隐性的(exclusively recessive)，因此不能被转入是多倍体的工业菌株。通常，获得的突变体仅具有针对用于筛选的蛋白的提高的分泌能力。融合蛋白手段需要在对每种异源或外源蛋白的融合分别进行融合构建的设计。融合蛋白通常没有功能，因此，需要通过蛋白水解来释放终产物，这使得生产过程复杂化。

由于它们作为蛋白生产者的工业重要性，人们仍需要获得具有提高的分泌能力的有丝真菌。

附图说明

图1：脯氨酸特异性内切蛋白酶表达载体pGBTOPEPO-1的质粒图谱。标注的是相对于glaA启动子和脯氨酸特异性内切蛋白酶epo基因的glaA侧翼区域。可通过在转入A.niger菌株之前用限制性酶HinDIII进行消化来去除E.coli DNA。

图2：PLA2表达载体pGBTOPPLA-2的质粒图谱。标注的是相对glaA启动子、截短的glaA基因和pro-pla2编码序列的glaA侧翼区域。可通过在转入A.niger菌株之前用限制性酶NotI进行消化来去除E.coliDNA。

图3：表达载体pGBFIN-18的质粒图谱。标注的是相对glaA启动子的glaA侧翼区域，所述启动子在葡糖淀粉酶启动子中具有独特的sfiI和EcoRI克隆位点，接着是PacI和AscI克隆位点。可通过在转入A.niger菌株之前用限制性酶NotI进行消化来去除E.coli DNA。

图4：表达载体pGBFINSEC-1的质粒图谱。标注的是相对glaA启动子、截短的glaA基因和A.niger基因组sec61基因的glaA侧翼区域。可通过在转入A.niger菌株之前用限制性酶NotI进行消化来去除E.coli DNA。

图5：表达载体pGBDEL-Sec61^*的质粒图谱。标注的是相对于amdS标记的Sec61^*突变体基因和3’Sec61^*突变体基因片段。可通过在转入A.niger菌株之前用限制性酶AscI和NotI进行消化来去除E.coli DNA。

图6：表达载体pGBFINSEC-3的质粒图谱。标注的是相对于glaApepC启动子和经修饰的sec61^*基因的glaA侧翼区域。可通过在转入A.niger菌株之前用限制性酶NotI进行消化来去除E.coli DNA。