[发明专利]改用超长引物以提高基因扩增效能的聚合酶链式反应方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术，即一种体外酶促合成特异DNA片段的聚合酶链式反应方法。

背景技术

聚合酶链式反应即PCR是一种简单、专一、灵敏的基因扩增方法，如《分子生物学理论与技术》(北京科学技术出版社2002年版)一书所述，为最常用的分子生物学技术之一。其基本过程是按照已知序列合成引物，以基因组DNA、文库DNA或cDNA为模板合成含内含子或不含内含子的基因片段。现行典型的PCR由1、高温变性模板；2、引物与模板退火；3、引物与模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下(通常为93-94℃)使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶(Taq酶)在72℃将单核苷酸从引物的3′端开始掺入，以目的基因为模板从5′→3′方向延伸，合成DNA的新互补链。PCR方法的必要成份有耐热DNA聚合酶，四种脱氧核糖核苷酸，镁离子、缓冲液、标靶DNA和引物。其中引物设计是PCR成功的决定性因子。引物的各项特性由引物长度，碱基组成和排列顺序决定。其中，引物长度是关键参数。引物长度范围受两方面的限制，引物较短容易在二级结构和引物互补特性方面满足要求，但往往反应专一性不够；引物较长，虽反应专一性达到标准，但往往因引物二级结构或引物间互补太强而不能使用。现普遍认为标准PCR通常充许的引物长度范围是15-30碱基，最适宜的引物长度范围是18-25碱基。若引物过长则成本增加，同模板DNA的杂交速率降低，特异性降低。

发明内容

本发明的就是要突破现有PCR方法中对引物设计长度的普遍认知和人为限定，提供一种能使非专一扩增产物和引物二聚物降低或消除，使目标扩增产物更强、更纯，能缩短反应时间，能减少反应所用的主要试剂量，使反应稳定性和重复性提高的PCR方法。

本发明聚合酶链式反应方法PCR的必要成份有：耐热DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸、镁离子、缓冲液、标靶DNA和一对正、反引物。其中，一对正、反引物的长度均为31-50碱基，优选为35-45碱基，谓之超长引物。超长引物的顺序原则上应与模板顺序完全互补，但根据需要可有个别的错配。正、反引物的链熔温度即Tm的范围均为82-92℃，优选为85-90℃。PCR产物的链熔温度减正、反引物链熔温度之差均为-4-10℃。正、反引物均具有较高的严谨性。本发明聚合酶链式反应PCR由于采用超长引物替代了一般长度引物，其PCR循环步骤由变性-退火-延伸三步简化为高温变性和退火延伸两步，退火和延伸合二为一，而且可以在远远超出标准PCR退火和延伸的极限值的条件下完成PCR反应。退火温度为72-82℃，延伸温度也为72℃-82℃，优选为75-80℃。本发明适用于标准PCR和反转录PCR、也可以用于竞争定量PCR和实时荧光定量PCR减少非专一产物形成。还可以用于多重PCR，嵌套PCR和其它由标准PCR衍生的各种改良PCR方法，有广泛的应用前景。

为理解本发明的实质及优点，随机选取下列十个基因进行测试分析：