[发明专利]一种递送siRNA的外泌体的制备方法

摘要

本发明涉及外泌体递送siRNA技术领域，提供一种递送siRNA的外泌体的制备方法，本发明在准备上清液的过程中将于‑80℃储存的血浆置于37℃水浴中，能够对冰冻的血浆进行融化，使其完全液态；然后通过沉淀试剂法对外泌体和血浆进行分离，并且通过离心的方式将外泌体和死亡细胞及其碎片进行去除，从而得到外泌体；然后分别分析外泌体的大小、产量、纯度、形态和标志物表达的特征，从而能够对所分离出的外泌体的特征进行表征分析，为后续封装siRNA至外泌体内的步骤做铺垫；最后通过电穿孔法将siRNA封装至所分离出的外泌体内，并通过粒度排除色谱法对游离的siRNA进行去除，从而能够得到纯度较高的封装有siRNA的外泌体，进而提高外泌体递送siRNA的效率。

主权项

1.一种递送siRNA的外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、制备上清液：先取出于-80℃储存的血浆置于37℃水浴中，完全液态后将其置于冰上；然后经2000×g离心20-30min去除细胞和碎片，再用移液枪吸取上清液至新的离心管内，再经10000×g离心20-30min；最后将所得上清液吸取至新的离心管内，并将其放置在冰上直至开始分离；/nS2、分离外泌体：将S1中开始分离的上清液吸取适当体积至新的离心管中，加入0.5×上清液体积的PBS后进行涡旋混匀；然后加入0.2×(上清液体积+PBS体积)的外泌体沉淀试剂，涡旋混匀后所得记为混合物；将所述混合物在室温下孵育10-15min后，于室温下10000×g离心5-10min，弃去上清液后所得颗粒即为外泌体；/nS3、外泌体的表征分析：对S2中得到的外泌体进行分析，所述分析包括以下步骤：/na、用纳米颗粒跟踪分析仪来表征外泌体大小和产量；/nb、用颗粒蛋白比测定法表征外泌体纯度；/nc、采用流式细胞术检测外泌体标志物表达的特征；/nd、使用透射电子显微镜表征外泌体形态；/nS4、封装siRNA至外泌体内：通过电穿孔将siRNA封装到经过S3表征分析后的外泌体中，所得记为混合物；/nS5、去除游离siRNA：采用粒度排除色谱法去除所述混合物中游离的siRNA，所得即为封装有siRNA的外泌体。/n