[发明专利]一种递送siRNA的外泌体的制备方法

权利要求书

1.一种递送siRNA的外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、制备上清液：先取出于-80℃储存的血浆置于37℃水浴中，完全液态后将其置于冰上；然后经2000×g离心20-30min去除细胞和碎片，再用移液枪吸取上清液至新的离心管内，再经10000×g离心20-30min；最后将所得上清液吸取至新的离心管内，并将其放置在冰上直至开始分离；

S2、分离外泌体：将S1中开始分离的上清液吸取适当体积至新的离心管中，加入0.5×上清液体积的PBS后进行涡旋混匀；然后加入0.2×(上清液体积+PBS体积)的外泌体沉淀试剂，涡旋混匀后所得记为混合物；将所述混合物在室温下孵育10-15min后，于室温下10000×g离心5-10min，弃去上清液后所得颗粒即为外泌体；

S3、外泌体的表征分析：对S2中得到的外泌体进行分析，所述分析包括以下步骤：

a、用纳米颗粒跟踪分析仪来表征外泌体大小和产量；

b、用颗粒蛋白比测定法表征外泌体纯度；

c、采用流式细胞术检测外泌体标志物表达的特征；

d、使用透射电子显微镜表征外泌体形态；

S4、封装siRNA至外泌体内：通过电穿孔将siRNA封装到经过S3表征分析后的外泌体中，所得记为混合物；

S5、去除游离siRNA：采用粒度排除色谱法去除所述混合物中游离的siRNA，所得即为封装有siRNA的外泌体。

2.根据权利要求1所述的一种递送siRNA的外泌体的制备方法，其特征在于，所述S1中离心在室温条件下进行。

3.根据权利要求1所述的一种递送siRNA的外泌体的制备方法，其特征在于，所述S2中PBS优选为1×PBS缓冲液。

4.根据权利要求1所述的一种递送siRNA的外泌体的制备方法，其特征在于，所述S3中在外泌体的表征分析过程中，需要对分析结果进行记录。

5.根据权利要求1所述的一种递送siRNA的外泌体的制备方法，其特征在于，所述S4中封装siRNA至外泌体内的具体操作步骤为：

1)先在冰上预冷电穿孔环30min，再按照1：60的摩尔比将外泌体和siRNA混合在微型离心管中，然后加入适量的柠檬酸缓冲液进行混合，所得记为预混合物；

2)将1)中的预混合物转移至电穿孔试管中进行电穿孔，电穿孔结束后所得即为混合物，并用移液管从试管中取出混合物进行下一步处理。

6.根据权利要求1所述的一种递送siRNA的外泌体的制备方法，其特征在于，所述S5中去除游离siRNA的具体操作步骤为：

1)先通过两次过滤350μLPBS来平衡SEC柱，再取150μL所述混合物溶解在350μL过滤过的PBS中，并将其转移至SEC柱内进行游离siRNA去除，然后收集从SEC柱中洗脱的前500μL组分；

2)再次向SEC柱中加入500μL过滤后的PBS，并收集接下来的500μL组分；

3)重复步骤2)，直到收集到10×500μL的总份数，此时能够对混合物中游离的siRNA进行去除，得到封装有siRNA的外泌体。