[发明专利]一种递送siRNA的外泌体的制备方法

说明书

本发明涉及外泌体递送siRNA技术领域，提供一种递送siRNA的外泌体的制备方法，本发明在准备上清液的过程中将于‑80℃储存的血浆置于37℃水浴中，能够对冰冻的血浆进行融化，使其完全液态；然后通过沉淀试剂法对外泌体和血浆进行分离，并且通过离心的方式将外泌体和死亡细胞及其碎片进行去除，从而得到外泌体；然后分别分析外泌体的大小、产量、纯度、形态和标志物表达的特征，从而能够对所分离出的外泌体的特征进行表征分析，为后续封装siRNA至外泌体内的步骤做铺垫；最后通过电穿孔法将siRNA封装至所分离出的外泌体内，并通过粒度排除色谱法对游离的siRNA进行去除，从而能够得到纯度较高的封装有siRNA的外泌体，进而提高外泌体递送siRNA的效率。

技术领域

本发明涉及外泌体递送siRNA技术领域，具体涉及一种递送siRNA的外泌体的制备方法。

背景技术

外泌体是天然的囊泡结构，真有得天独厚的生物相容性，其本身内部就含有核酸和蛋白，故近年来将外泌体作为递送系统是一个很热的研究方向。细胞外囊泡，特别是外泌体，由于其生物学起源、丰富性和内在的能力，近年来作为新型药物传递载体受到关注。siRNA为小干扰RNA，能够引起RNA干扰，其中RNA干扰是对基因转录后的表达过程进行特异性的抑制从而达到基因沉默的目的；而且外泌体作为载体，能够实现对siRNA进行递送。siRNA可以通过电穿孔成功地装载到外泌体中，然后使外泌体在体外传递到癌细胞中，该方案提供了一个标准的程序，开发装载siRNA的外泌体，以有效地传递到癌细胞内。

发明内容

解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种递送siRNA的外泌体的制备方法，旨在能够开发装载siRNA的外泌体，从而将siRNA有效地传递到癌细胞内。

技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种递送siRNA的外泌体的制备方法，包括以下步骤：

S1、制备上清液：先取出于-80℃储存的血浆置于37℃水浴中，完全液态后将其置于冰上；然后经2000×g离心20-30min去除细胞和碎片，再用移液枪吸取上清液至新的离心管内，再经10000×g离心20-30min；最后将所得上清液吸取至新的离心管内，并将其放置在冰上直至开始分离；

S2、分离外泌体：将S1中开始分离的上清液吸取适当体积至新的离心管中，加入0.5×上清液体积的PBS后进行涡旋混匀；然后加入0.2×(上清液体积+PBS体积)的外泌体沉淀试剂，涡旋混匀后所得记为混合物；将所述混合物在室温下孵育10-15min后，于室温下10000×g离心5-10min，弃去上清液后所得颗粒即为外泌体；

S3、外泌体的表征分析：对S2中得到的外泌体进行分析，所述分析包括以下步骤：

a、用纳米颗粒跟踪分析仪来表征外泌体大小和产量；

b、用颗粒蛋白比测定法表征外泌体纯度；

c、采用流式细胞术检测外泌体标志物表达的特征；

d、使用透射电子显微镜表征外泌体形态；

S4、封装siRNA至外泌体内：通过电穿孔将siRNA封装到经过S3表征分析后的外泌体中，所得记为混合物；

S5、去除游离siRNA：采用粒度排除色谱法去除所述混合物中游离的siRNA，所得即为封装有siRNA的外泌体。

更进一步地，所述S1中离心在室温条件下进行。

更进一步地，所述S2中PBS优选为1×PBS缓冲液。

更进一步地，所述S3中在外泌体的表征分析过程中，需要对分析结果进行记录。