[发明专利]一种简易分离烟草青枯病菌的方法

摘要

本发明公开一种简易分离烟草青枯病菌的方法，其特征包括以下步骤：1病样采集；2病原菌分离；3病原菌培养；4菌悬液制备；5PCR扩增与鉴定。本发明采集田间病叶，切取叶柄处的叶脉维管束，利用叶脉维管束中青枯菌的含量远高于其他微生物这一特点，分离纯化烟草青枯病菌，本发明目标选择性强，纯化速度快，效率高，分离纯化率在84％以上，而且可确保为该病病原菌。采用本发明，可快捷准确地获得目标病原，为后续研究奠定基础。一般的科技人员也十分容易掌握本方法。

主权项

1.一种简易分离烟草青枯病菌的方法，其特征包括以下步骤：(1)病样采集从田间发病烟株采集病叶，观察叶脉维管束是否有黑色斑点，若有则视为青枯病发病株；将整片烟叶放入采样袋，带回实验室；(2)病原菌分离去除叶柄以外的组织，用酒精表面消毒，用无菌刀片切除叶脉维管束以外的上表皮、栅栏组织、海绵组织和下表皮，切取叶柄基部的叶脉维管束；将叶脉维管束用无菌刀片切成若干组织块；置于含有无菌水的灭菌培养皿中浸泡5‑10min，待组织块周围有乳白色菌液溢出后，用无菌枪头混匀菌液；(3)病原菌培养用移液器吸取菌液于含有TTC的平板中，用无菌牙签划线稀释菌液，置于超净工作台吹干；置于28‑30℃培养箱中暗培养24‑48h，于22‑25h后形成透明的小菌落，36‑48h后菌落呈不规则形或近圆形，具有较宽的白边，流动性较强，中间呈粉红色或浅红色稀液状；(4)菌悬液制备(5)PCR扩增与鉴定烟草青枯菌的PCR鉴定采用青枯菌检测的通用引物Rs‑759(5'‑GTCGCCGTCAACTCACTTTCC‑3')和Rs‑760(5'‑GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG‑3')扩增特异片段，扩增结束后取PCR产物各3‑7μL，加载于2％的琼脂糖凝胶的胶孔中，以适当的DNA标样为对照，在120V恒压下分离30‑45min，将凝胶浸泡于含5μg/mL EB的核酸染液10min；置于凝胶成像仪上获取PCR产物分离情况，若为烟草青枯菌则在200和300bp之间接近300bp处有扩增产物条带。