[发明专利]一种简易分离烟草青枯病菌的方法

说明书

本发明公开一种简易分离烟草青枯病菌的方法，其特征包括以下步骤：1病样采集；2病原菌分离；3病原菌培养；4菌悬液制备；5PCR扩增与鉴定。本发明采集田间病叶，切取叶柄处的叶脉维管束，利用叶脉维管束中青枯菌的含量远高于其他微生物这一特点，分离纯化烟草青枯病菌，本发明目标选择性强，纯化速度快，效率高，分离纯化率在84％以上，而且可确保为该病病原菌。采用本发明，可快捷准确地获得目标病原，为后续研究奠定基础。一般的科技人员也十分容易掌握本方法。

技术领域

本发明属于植物病害技术领域，具体涉及一种简易分离烟草青枯病菌的方法。

背景技术

烟草青枯病(Tobacco bacterial wilt)是热带、亚热带地区烟草的主要病害之一。1880年，烟草青枯病首先发现于美国北卡罗来纳州格兰维尔(Granville)，也称作“Granville wilt”，而后在印度尼西亚、日本、澳大利亚和韩国等国逐渐演变为烟草上的重要病害。该病害在我国长江流域及其以南各烟区普遍发生，其中广西、广东、福建、湖南、浙江、安徽、四川及贵州等省危害严重。云南省早在1987年就有烟草青枯病的报道，但危害较轻。2002年以来，云南省南部旱地烟区青枯病危害逐渐加重，局部地块发病率达到80％以上。目前，该病在云南省的文山、保山、临沧、红河、昆明、玉溪、曲靖、昭通、大理、丽江、楚雄和德宏等州市均有发生，其中文山、临沧、保山和德宏的部分地区发病较为严重。虽然烟草青枯病在云南省发病较为严重，但对该病的研究相对不足，尤其在病原学方面的研究尚少。分离纯化该病病原菌获得纯培养物是开展相关研究的基础。

烟草青枯病为青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)侵染引起的细菌性土传病害。病原菌菌体杆状，两端钝圆，大小0.9-2μm×0.5-0.8μm，有1-3根鞭毛，多单极生，无荚膜。病菌生长温限10℃-37℃，30-35℃最适。现有的分离方法为组织分离法，用灭菌后的刀削去植株茎杆病健交界处的表皮，取病健交界处的维管束组织，置于无菌水中浸泡后划线稀释菌液的方法纯化病原菌。由于烟草青枯病经常与黑胫病等根茎病害混合发生，加之显症茎杆中含有大量其他腐生菌。因此，该方法常会分离到多种其他的微生物，而得不到该病病原菌，分离纯化效率低。一般的科技人员采用组织分离法，常会导致分离不到烟草青枯病，将目标病原搞错。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种简易分离烟草青枯病菌的方法，该方法能快速而准确地获得该病病原菌，有效排除其他病菌，提高分离纯化效率。

一种简易分离烟草青枯病菌的方法，其特征在于包括以下步骤：

1、病样采集

从田间采集发病的叶片，观察叶脉维管束是否有黑色斑点，若有则视为青枯病发病株；将整片叶片放入采样袋，带回实验室。

2、病原菌分离

去除叶柄以外的组织，用酒精表面消毒，用无菌刀片切除叶脉维管束以外的上表皮、栅栏组织、海绵组织和下表皮，切取叶柄基部的叶脉维管束；将叶脉维管束用无菌刀片切成若干块的组织块；置于含有无菌水的灭菌培养皿中浸泡5-10min，待组织块周围有乳白色菌液溢出后，用无菌枪头混匀菌液。

3、病原菌培养

用移液器吸取菌液滴加到TTC平板的一侧，用无菌牙签划线，超净工作台吹干后置于28-30℃培养箱中暗培养24-48h。22-25h后形成透明的小菌落，36-48h后形成不规则形或近圆形菌落，具有较宽的白边，流动性较强，中间呈粉红色或浅红色稀液状。

4、菌悬液制备

5、PCR扩增与鉴定

烟草青枯菌的PCR鉴定采用通用引物Rs-759

(5'-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC-3')和Rs-760