[发明专利]一种简易分离烟草青枯病菌的方法

权利要求书

1.一种简易分离烟草青枯病菌的方法，其特征包括以下步骤：

(1)病样采集

从田间发病烟株采集病叶，观察叶脉维管束是否有黑色斑点，若有则视为青枯病发病株；将整片烟叶放入采样袋，带回实验室；

(2)病原菌分离

去除叶柄以外的组织，用酒精表面消毒，用无菌刀片切除叶脉维管束以外的上表皮、栅栏组织、海绵组织和下表皮，切取叶柄基部的叶脉维管束；将叶脉维管束用无菌刀片切成若干组织块；置于含有无菌水的灭菌培养皿中浸泡5-10min，待组织块周围有乳白色菌液溢出后，用无菌枪头混匀菌液；

(3)病原菌培养

用移液器吸取菌液于含有TTC的平板中，用无菌牙签划线稀释菌液，置于超净工作台吹干；

置于28-30℃培养箱中暗培养24-48h，于22-25h后形成透明的小菌落，36-48h后菌落呈不规则形或近圆形，具有较宽的白边，流动性较强，中间呈粉红色或浅红色稀液状；

(4)菌悬液制备

(5)PCR扩增与鉴定

烟草青枯菌的PCR鉴定采用青枯菌检测的通用引物Rs-759(5'-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC-3')和Rs-760(5'-GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG-3')扩增特异片段，扩增结束后取PCR产物各3-7μL，加载于2％的琼脂糖凝胶的胶孔中，以适当的DNA标样为对照，在120V恒压下分离30-45min，将凝胶浸泡于含5μg/mL EB的核酸染液10min；置于凝胶成像仪上获取PCR产物分离情况，若为烟草青枯菌则在200和300bp之间接近300bp处有扩增产物条带。

2.根据权利要求1所述的一种简易分离烟草青枯病菌的方法，其特征在于：步骤1采集的叶片，典型病状为叶片一边部分叶肉组织呈水泽状、萎蔫、变黄、膏药状枯斑或病叶一边发育不正常而弯曲变形。

3.根据权利要求1所述的一种简易分离烟草青枯病菌的方法，其特征在于：步骤2中，用酒精表面消毒时，使用70％酒精进行表面消毒，时间为3-7min；切取叶脉维管束时，切取的长度为3-5cm；所述组织块大小为3-5mm×3-5mm；所述灭菌培养皿中的无菌水为8-12mL；所述无菌枪头为10mL无菌枪头。

4.根据权利要求1所述的一种简易分离烟草青枯病菌的方法，其特征在于：步骤3中，吸取的菌液含量为15-30μL；所述TTC平板的制作方法为：分别称取蛋白胨10.0g、葡萄糖10.0g、酪素水解物1.0g和琼脂15.0g，加蒸馏水定容至1L，121℃高压灭菌20min后置于55℃水浴锅，待培养基温度降至55℃时加入终浓度为0.005％的氯化三苯基四氮唑，混匀后在每个无菌培养皿中加入23-28mL培养基，冷凝后制成的平板为含TTC的平板。

5.根据权利要求1所述的一种简易分离烟草青枯病菌的方法，其特征在于：步骤4中，菌悬液的制备方法为用10μL无菌枪头挑取菌体于含有10μL无菌水的PCR管中，涡旋震荡后取1μL用于菌落PCR鉴定分离物。

6.根据权利要求1所述的一种简易分离烟草青枯病菌的方法，其特征在于：步骤5中，PCR反应体系为25μL，反应体系由12.5μL 2×Es Taq MasterMix(Dye)、10.5μL ddH₂O、0.5μL 10μM Rs-759、0.5μL 10M Rs-760和1μL菌悬液组成；

PCR反应条件为94℃预变性2min，扩增循环包括94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s，扩增30个循环，最后72℃延伸2min，并将PCR产物保存于4℃或直接用于琼脂糖凝胶电泳。

7.根据权利要求1所述的一种简易分离烟草青枯病菌的方法，其特征在于：步骤(5)所述的在200和300bp之间接近300bp处的条带为位于281bp处的条带。