[发明专利]一种抗A型口蹄疫病毒牛源单链基因工程抗体的制备方法在审
| 申请号： | 201910694887.1 | 申请日： | 2019-07-30 |
| 公开（公告）号： | CN110483638A | 公开（公告）日： | 2019-11-22 |
| 发明（设计）人： | 李坤;曹轶梅;卢曾军;刘在新;包慧芳;王省;周莎莎;白兴文;李平花;付元芳 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院兰州兽医研究所 |
| 主分类号： | C07K16/10 | 分类号： | C07K16/10;C12N15/13;C12N15/85 |
| 代理公司： | 11569 北京高沃律师事务所 | 代理人： | 瞿晓晶<国际申请>=<国际公布>=<进入 |
| 地址： | 730046 甘肃*** | 国省代码： | 甘肃;62 |
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| 摘要： | 本发明涉及一种抗A型口蹄疫病毒牛源单链基因工程抗体的制备方法，属于抗体制备技术领域。本发明所述制备方法通过从免疫A型FMDV灭活疫苗牛体内分离PBMCs，使用染料标A型FMDV 146S抗原，然后对PBMCs进行染色，借助多色流式细胞仪分选能同时分离到结合A型FMDV的单个B细胞，进而获得VH和VL基因，结合EXPI293表达工程抗体技术，表达获得A型FMDV特异性牛源单链基因工程抗体。本发明所述制备方法避免了传统鼠杂交瘤技术复杂的细胞融合筛选流程，对研究A型FMDV宿主特异性抗原位点的鉴定具有重要指导意义，可为口蹄疫分子疫苗的研制奠定基础。 | ||
| 搜索关键词： | 制备 基因工程抗体 单链 抗体制备技术 宿主 口蹄疫病毒 流式细胞仪 特异性抗原 分子疫苗 工程抗体 灭活疫苗 鼠杂交瘤 细胞融合 抗原 染料 染色 多色 分选 位点 口蹄疫 体内 筛选 研究 | ||
【主权项】：
1.一种抗A型口蹄疫病毒牛源单链基因工程抗体的制备方法，包括以下步骤：/n1)从免疫A型FMDV灭活疫苗的牛血液样本中分离外周血单个核细胞；/n2)对A型FMDV 146S抗原进行超滤离心，得到浓缩后的A型FMDV 146S抗原，使用染料对浓缩后的A型FMDV 146S抗原进行染色，将染色后的抗原进行超滤离心，得到标记后的A型FMDV 146S抗原；/n所述染料包括FluoProbes 647H、Allophycocyanin、DyLight 633、DyLight 650、Atto633或Cynaine Dye 5；/n3)将步骤1)得到的外周血单个核细胞与步骤2)得到的标记后的A型FMDV 146S抗原、鼠抗牛CD21-RPE和鼠抗牛IgM-FITC荧光抗体混合，得到染色后的细胞；/n4)使用多色流式细胞仪分选A型FMDV特异性单个B细胞；/n5)对步骤4)得到的A型FMDV特异性单个B细胞进行反转录，得到cDNA后进行扩增，得到A型FMDV特异性单个B细胞IgG抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因；/n6)将步骤5)得到的重链可变区基因和轻链可变区基因通过如SEQ ID NO.1的柔性Linker连接，在连接后的基因的N端引入如SEQ ID NO.2所述的信号肽序列，在C端引入Flag标签和His标签，参考Homo sapiens(Human)密码子进行基因序列优化，在优化后的基因起始密码子前引入KOZAK序列，插入到pcDNA3.4表达载体，得到牛源单链抗体表达载体；/n7)将步骤6)得到牛源单链抗体表达载体转染细胞进行抗体的表达；/n所述步骤1)和2)没有时间先后顺序的限定。/n
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