[发明专利]一种抗A型口蹄疫病毒牛源单链基因工程抗体的制备方法

权利要求书

1.一种抗A型口蹄疫病毒牛源单链基因工程抗体的制备方法，包括以下步骤：

1)从免疫A型FMDV灭活疫苗的牛血液样本中分离外周血单个核细胞；

2)对A型FMDV 146S抗原进行超滤离心，得到浓缩后的A型FMDV 146S抗原，使用染料对浓缩后的A型FMDV 146S抗原进行染色，将染色后的抗原进行超滤离心，得到标记后的A型FMDV 146S抗原；

所述染料包括FluoProbes 647H、Allophycocyanin、DyLight 633、DyLight 650、Atto633或Cynaine Dye 5；

3)将步骤1)得到的外周血单个核细胞与步骤2)得到的标记后的A型FMDV 146S抗原、鼠抗牛CD21-RPE和鼠抗牛IgM-FITC荧光抗体混合，得到染色后的细胞；

4)使用多色流式细胞仪分选A型FMDV特异性单个B细胞；

5)对步骤4)得到的A型FMDV特异性单个B细胞进行反转录，得到cDNA后进行扩增，得到A型FMDV特异性单个B细胞IgG抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因；

6)将步骤5)得到的重链可变区基因和轻链可变区基因通过如SEQ ID NO.1的柔性Linker连接，在连接后的基因的N端引入如SEQ ID NO.2所述的信号肽序列，在C端引入Flag标签和His标签，参考Homo sapiens(Human)密码子进行基因序列优化，在优化后的基因起始密码子前引入KOZAK序列，插入到pcDNA3.4表达载体，得到牛源单链抗体表达载体；

7)将步骤6)得到牛源单链抗体表达载体转染细胞进行抗体的表达；

所述步骤1)和2)没有时间先后顺序的限定。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤1)所述牛血液样本为免疫A型FMDV灭活疫苗14～30d的牛血液样本。

3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤2)所述超滤离心为：使用截留量100kDa的超滤管4000rpm离心10min，将抗原或染色后的抗原置换至PBS缓冲液中。

4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤4)所述分选为：把每孔含有10μL裂解液的96-PCR孔板放入分选舱，设置每孔分选1个细胞模式，上样；划门圈出淋巴及单核细胞，根据FSC-A与FSA-H设置排除粘连细胞，圈出对角线单一细胞；对CD21⁺IgM^-A-FMDV⁺细胞进行分选。

5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤5)所述扩增包括巢式PCR扩增方法。

6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤6)使用Not1和Nhel酶切位点插入到pcDNA3.4表达载体。

7.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤7)所述细胞包括Expi293悬浮细胞。