[发明专利]一种抗A型口蹄疫病毒牛源单链基因工程抗体的制备方法

说明书

本发明涉及一种抗A型口蹄疫病毒牛源单链基因工程抗体的制备方法，属于抗体制备技术领域。本发明所述制备方法通过从免疫A型FMDV灭活疫苗牛体内分离PBMCs，使用染料标A型FMDV 146S抗原，然后对PBMCs进行染色，借助多色流式细胞仪分选能同时分离到结合A型FMDV的单个B细胞，进而获得VH和VL基因，结合EXPI293表达工程抗体技术，表达获得A型FMDV特异性牛源单链基因工程抗体。本发明所述制备方法避免了传统鼠杂交瘤技术复杂的细胞融合筛选流程，对研究A型FMDV宿主特异性抗原位点的鉴定具有重要指导意义，可为口蹄疫分子疫苗的研制奠定基础。

技术领域

本发明涉及抗体制备技术领域，具体涉及一种抗A型口蹄疫病毒牛源单 链基因工程抗体的制备方法。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是严重危害猪、牛与羊的重大动 物疫病。口蹄疫病毒(FMDV)有七个血清型，分别为A型、O型、Asia 1 型、C型、SAT1～3型，其中每个血清型又根据流行的区域划分为多个拓扑 型(VP1，85％氨基酸同源性)。我国主要流行A型和O型FMDV，其中A 型FMDV在我国主要存在亚洲拓扑型中的G1和G2分支。A型和O型FMDV 血清型之间不能提供交叉免疫保护，甚至同一血清型内不同拓扑型病毒之间 也存在抗原结构的差异，不能对异源毒株提供很好的交叉免疫保护。因此， 研究A型FMDV抗原结构对疫苗毒株设计具有重要意义。单克隆抗体无疑 是解析抗原结构的重要工具。

单克隆抗体来源于B细胞，抗体胚系基因VDJ片段通过基因重排和体 细胞突变，产生特异性单个B细胞克隆，B细胞进一步分化成浆细胞，最终 分泌产生特异性单克隆抗体。可以看出抗体胚系基因VDJ重排决定了抗体 的多样性，然而不同物种在VDJ基因片段数量上存在很大差异。据报道， 小鼠重链IGH基因含有101个V基因片段，9个D基因片段，4个J基因片 段。猪重链IGH基因约有20个功能性V基因片段,2个D基因片段和1个 J基因片段。目前，牛重链IGH基因数据库中存在12个V基因片段,23个 D基因片段和4J基因片段(http://www.imgt.org/IMGTveterinary/)。抗体分子 中互补决定区(CDRs)是识别抗原表位的重要部位，尤其是重链互补决定 区(HCDR3)，影响抗体亲和力。牛抗体分子中约10％重链序列含有超长 的HCDR3，最长可达约60个氨基酸，这一特性是其他物种，如小鼠和猪等 所不具备的。据报道，牛超长HCDR3结构域可以单独识别抗原表位。综上 可以看出，不同物种间VDJ基因组成差异以及CDR3长度差异，以及K/L 轻链组成比例差异，所引起的抗体多样性，势必可能导致宿主特异性抗原位 点的产生。因此，利用自然宿主来源单抗鉴定其识别抗原位点对解析A型 FMDV抗原结构和疫苗设计具有重要指导意义。目前，用于研究A型FMDV 抗原结构的单克隆抗体主要是鼠源性单克隆抗体。然而由于牛是FMDV的 自然感染宿主，且鼠与牛的B细胞多样性存在较大差异，因此产生A型 FMDV特异性牛源单克隆抗体对解析A型FMDV抗原结构，尤其是发现 FMDV宿主特异性抗原位点具有重要意义。目前，尚未有A型FMDV特异 性牛源单克隆抗体的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗A型口蹄疫病毒牛源单链基因工程抗体 的制备方法。本发明所述制备方法操作简单、方便，避免了传统鼠杂交瘤技 术复杂的细胞融合筛选流程，可以通过流式细胞仪直接分选抗原特异性单个 B细胞，体外表达获得单链基因工程抗体，对研究A型FMDV宿主特异性 抗原位点的鉴定具有重要指导意义，可为口蹄疫分子疫苗的研制奠定基础。

本发明提供了一种抗A型口蹄疫病毒牛源单链基因工程抗体的制备方 法，包括以下步骤：

1)从免疫A型FMDV灭活疫苗的牛血液样本中分离外周血单个核细胞；