[发明专利]一种验证CRISPR-Cas9系统介导目标基因插入产朊假丝酵母的可行性的方法

摘要

验证CRISPR‑Cas9系统介导目标基因插入产朊假丝酵母的可行性的方法，步骤：S1、构建包含Cas9片段的产朊假丝酵母表达载体；S2、扩增tRNAGlu基因、sgRNA下游表达单元，并重叠PCR连接并引入酶切位点，连接后与产朊假丝酵母载体结合得sgRNA初步重组质粒；S3、选定预插入和靶点序列，在靶点及互补序列5’端加粘性末端，退火成双链片段，与酶切后的初步重组质粒连接得sgRNA成熟重组质粒；S4、构建含有预插入序列左右同源臂的重组供体片段；S5、sgRNA重组质粒和重组供体片段转化携带Cas9的产朊假丝酵母；通过鉴定供体片段表达，验证了Cas9系统介导目标基因插入产朊假丝酵母是否可行。

主权项

1.一种验证CRISPR‑Cas9系统介导目标基因插入产朊假丝酵母的可行性的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、使用限制性核酸内切酶对酵母Cas9表达载体和第一产朊假丝酵母游离型表达载体进行双酶切，并连接产生的Cas9片段和第一游离型表达载体骨架片段，获得重组质粒pCGGαAL‑Cas9；S2、扩增产朊假丝酵母编码谷氨酸的转运RNA(tRNA_Glu)基因、sgRNA下游表达单元，并分别引入IIS类限制性核酸内切酶酶切位点，tRNA_Glu基因与sgRNA扩增产物通过酶切位点进行重叠PCR连接；重叠后的片段以及第二产朊假丝酵母游离型表达载体经双酶切后连接在一起，获得载体pGlu‑sgRNA。S3、选定产朊假丝酵母基因中的预插入序列和靶点序列，分别在靶点序列及互补序列的5’端加上IIS类限制性核酸内切酶产生的粘性末端，经退火形成带有5’突出粘性末端的双链片段，将双链片段与IIS类限制性核酸内切酶酶切载体pGlu‑sgRNA后获得的骨架连接，获得重组质粒pGlu‑sgRNA‑预插入序列，即sgRNA重组质粒；S4、构建含有预插入序列左右同源臂的重组供体片段；S5、sgRNA重组质粒和重组供体片段转化携带重组质粒pCGGαAL‑Cas9的产朊假丝酵母，直接或间接测定供体片段的基因表达水平验证Cas9介导目标基因插入产朊假丝酵母是否可行。