[发明专利]一种验证CRISPR-Cas9系统介导目标基因插入产朊假丝酵母的可行性的方法

说明书

验证CRISPR‑Cas9系统介导目标基因插入产朊假丝酵母的可行性的方法，步骤：S1、构建包含Cas9片段的产朊假丝酵母表达载体；S2、扩增tRNA_Glu基因、sgRNA下游表达单元，并重叠PCR连接并引入酶切位点，连接后与产朊假丝酵母载体结合得sgRNA初步重组质粒；S3、选定预插入和靶点序列，在靶点及互补序列5’端加粘性末端，退火成双链片段，与酶切后的初步重组质粒连接得sgRNA成熟重组质粒；S4、构建含有预插入序列左右同源臂的重组供体片段；S5、sgRNA重组质粒和重组供体片段转化携带Cas9的产朊假丝酵母；通过鉴定供体片段表达，验证了Cas9系统介导目标基因插入产朊假丝酵母是否可行。

技术领域

本发明涉及基因插入领域，更具体地，涉及一种验证CRISPR-Cas9系统介导目标基因插入产朊假丝酵母的可行性的方法。

背景技术

酵母是简单的单细胞真核生物，它具有严密的真核基因表达调控系统，还具有种类丰富、易培养、大多无致病性等特点。酿酒酵母和毕赤酵母已被作为细胞工厂用来生产各种外源蛋白，但其作为宿主仍存在多处不足，比如大量的宿主酵母会出现质粒缺失的现象；酿酒酵母通常在发酵过程中会有乙醇产生，不利于高密度发酵；重组蛋白在酵母中表达时通常会发生超糖基化的现象；毕赤酵母在表达外源蛋白时需要添加甲醇进行诱导，这些缺陷限制了酵母表达系统的发展，因此，需要开发一种安全、高效的酵母表达系统用于食品、药物蛋白的生产。

产朊假丝酵母(Candida utilis)，是可以作为食品添加剂直接添加使用的安全酵母，可以将其运用于食品、制药等行业。产朊假丝酵母也是工业生产中非常重要的一种微生物，目前已作为宿主用来生产氨基酸、单细胞蛋白饲料和谷胱甘肽等。与毕赤酵母和酿酒酵母相比，产朊假丝酵母具有以下特性：1.可以同时利用五碳糖和六碳糖；2.易培养，能以硝酸盐和尿素作为氮源，能以糖蜜作为营养物质进行生长，且培养基中不需要加入任何的生长因子；3.在严格好氧培养条件下不具有酵解抑制有氧氧化效应，因此不会生成副产物乙醇；4.可以作为食品添加剂直接添加使用。基于上述产朊假丝酵母的优点，建立一种产朊假丝酵母表达系统对酵母表达系统的工业应用、发展具有必要性。

由于产朊假丝酵母中没有稳定的附加型质粒，现有的产朊假丝酵母表达系统主要采用整合型表达载体将外源基因整合到产朊假丝酵母染色体上；但C.utilis基因组是多倍体菌株，利用整合型载体进行同源重组时，由于所有的染色体不能同时整合成功，整合片段会容易发生回复突变，即整合进入产朊假丝酵母基因组中的目的片段会被重新从基因组中释放出来；而且外源基因整合时一般都带有抗性筛选标记基因，该筛选标记基因较难去除，导致整个整合过程繁琐复杂。而利用游离型的载体表达外源基因则会存在载体稳定性的问题，为维持载体的稳定，需要在培养基里添加抗生素，增加了成本也带来抗生素滥用等问题。C.utilis另外一种常规的基因改造方法是采用Cre-loxP重组酶系统，这个系统存在操作繁琐、耗时长等缺点。

因此，现有技术中缺乏针对于产朊假丝酵母简单而有效的基因编辑方法，对于产朊假丝酵母工程菌株的改造来说是个技术瓶颈。此外，针对于产朊假丝酵母的基因编辑方法还有 ZFNs方法、TALENs技术，但ZFNs方法中模块组装的锌指蛋白活性比较低，有效的锌指蛋白并不容易获得，该方法的成本较高，TALENs技术则需要组装多个重复模块，过程非常繁琐。现有技术中还存在一种利用CRISPR-Cas9系统的基因改造方法，以下简称Cas9系统，与前两种基因编辑技术相比，CRISPR-Cas9系统中的载体构建更简单、方便，且应用该系统的基因编辑方法在编辑上具有非常高的精确性，其应用领域也更广阔。作为一种新型的基因编辑技术CRISPR-Cas9可通过单一的引导RNA(sgRNA)引导Cas9蛋白识别目标序列并切断DNA双链，使细胞以同源重组或非同源末端连接的方式修复受损DNA，从而实现对目标基因的靶向敲除、插入等目的。