[发明专利]一种验证CRISPR-Cas9系统介导目标基因插入产朊假丝酵母的可行性的方法

权利要求书

1.一种验证CRISPR-Cas9系统介导目标基因插入产朊假丝酵母的可行性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、使用限制性核酸内切酶对酵母Cas9表达载体和第一产朊假丝酵母游离型表达载体进行双酶切，并连接产生的Cas9片段和第一游离型表达载体骨架片段，获得重组质粒pCGGαAL-Cas9；步骤S1中双酶切采用的酶为限制性内切酶SpeI和KpnI；

S2、扩增产朊假丝酵母编码谷氨酸的转运RNA（tRNA_Glu）基因、sgRNA下游表达单元，并分别引入ⅡS类限制性核酸内切酶酶切位点，tRNA_Glu基因与sgRNA扩增产物通过酶切位点进行重叠PCR连接；重叠后的片段以及第二产朊假丝酵母游离型表达载体经双酶切后连接在一起，获得载体pGlu-sgRNA；步骤S2双酶切采用的酶为限制性内切酶PstI和BamHI；

S3、选定产朊假丝酵母基因中的预插入序列和靶点序列，分别在靶点序列及互补序列的5’端加上ⅡS类限制性核酸内切酶产生的粘性末端，经退火形成带有5’突出粘性末端的双链片段，将双链片段与ⅡS类限制性核酸内切酶酶切载体pGlu-sgRNA后获得的骨架连接，获得重组质粒pGlu-sgRNA-预插入序列，即sgRNA重组质粒；

S4、构建含有预插入序列左右同源臂的重组供体片段；

S5、sgRNA重组质粒和重组供体片段转化携带重组质粒pCGGαAL-Cas9的产朊假丝酵母，直接或间接测定供体片段的基因表达水平验证Cas9介导目标基因插入产朊假丝酵母是否可行；

所述步骤S2包括以下步骤：

（1）扩增产朊假丝酵母编码谷氨酸的转运RNA（tRNA_Glu）基因，扩增过程中的下游引物5’端引入ⅡS类限制性核酸内切酶酶切位点；扩增sgRNA下游表达单元，扩增过程中的上游引物5’端引入方向相反的两个ⅡS类限制性核酸内切酶酶切位点；

（2）将扩增的tRNA_Glu基因与sgRNA扩增产物进行重叠PCR连接获得连接产物，分别对连接产物和第二产朊假丝酵母游离型表达载体进行双酶切，并连接酶切后的连接产物、第二游离型表达载体骨架片段，获得载体pGlu-sgRNA；

所述预插入序列为PGK启动子序列，所选的靶点序列为：AGCAGGCCTACAATTACGGATGG，下划线为PAM序列。

2.根据权利要求1所述的一种验证CRISPR-Cas9系统介导目标基因插入产朊假丝酵母的可行性的方法，其特征在于，所述步骤S4中的同源重组供体片段构建的步骤包括：

（1）设计上下游引物扩增供体片段；

（2）设计上下游引物扩增预插入序列，并在预插入序列上游引物5’端引入供体片段下游引物的反向互补序列；

（3）通过重叠PCR获得包含预插入序列同源臂的重组供体片段。

3.根据权利要求1所述的一种验证CRISPR-Cas9系统介导目标基因插入产朊假丝酵母的可行性的方法，其特征在于，所述ⅡS类限制性核酸内切酶为BsmBI酶。

4.根据权利要求1所述的一种验证CRISPR-Cas9系统介导目标基因插入产朊假丝酵母的可行性的方法，其特征在于，步骤S4中的供体片段为GFP基因或果胶甲酯酶基因。

5.根据权利要求1至4任一项所述的一种验证CRISPR-Cas9系统介导目标基因插入产朊假丝酵母的可行性的方法，其特征在于，所述sgRNA下游表达单元包括sgRNA的结构区和转录终止子区。

6.根据权利要求1至4任一项所述的一种验证CRISPR-Cas9系统介导目标基因插入产朊假丝酵母的可行性的方法，其特征在于，步骤S5 中的sgRNA质粒和重组供体片段还转化野生型产朊假丝酵母，直接或间接的测定不同产阮假丝酵母中供体片段的表达状况来验证Cas9介导目标基因插入产朊假丝酵母是否可行。

7.根据权利要求1至4任一项所述的一种验证CRISPR-Cas9系统介导目标基因插入产朊假丝酵母的可行性的方法，其特征在于，重叠PCR产物或重组质粒或重组产生的载体均需进行阳性克隆筛选。