[发明专利]一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR-SBT方法及试剂

摘要

本发明属于基因分型检测方法技术领域，具体涉及一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR‑SBT方法。本发明还涉及一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型试剂。本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决了KIR3DL2精确分型的问题，发挥PCR‑SBT对KIR3DL2分型操作简便、结果准确的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的相关应用将受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。

主权项

1.一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR‑SBT方法，其特征在于：所述方法对KIR3DL2基因编码区全长序列包括第1号外显子至第9号外显子进行分组PCR扩增和测序分型，并包括以下步骤：（1）设计并合成PCR扩增引物和测序引物，针对KIR3DL2基因特异性序列；（2）制备人基因组DNA；（3）分四组PCR反应扩增人基因组DNA中KIR3DL2基因第1号外显子至第9号外显子序列；（4）将步骤（3）得到的扩增产物进行双酶切纯化；（5）提供寡核苷酸测序引物，将步骤（4）得到的双酶切纯化产物进行测序PCR反应；（6）将步骤（5）得到的测序产物进行醋酸钠‑乙醇沉淀法纯化，并进行毛细管电泳测序；（7）将步骤（6）获得的序列通过软件分析，确定其基因型；所述步骤（1）中PCR扩增引物序列分别为：KIR3DL2基因第1号外显子的扩增引物：5UTR 5'‑GCCTCATGCAAGGTAGAAAGA‑3'I2R 5'‑TTGGGGAMGGACTCACCCATGA‑3'KIR3DL2基因第2号外显子至第6号外显子的扩增引物：E1F 5'‑GTCGTCAGCATGGYGTGC‑3'i6R 5'‑AGACAGGCCCTCATTCACAG‑3'KIR3DL2基因第6号外显子至第9号外显子的扩增引物：F3 5'‑CTTCACCCACAGAACCAAGC‑3'E9R 5'‑CTTCACCCACAGAACCAAGC‑3'KIR3DL2基因第9号外显子的扩增引物：E7F 5'‑CATCCTCCTCCTCTTCTTTCTCCTTT‑3'3UTR 5'‑CAGAAGGCTGAAAGATAGTCTGA‑3'；所述步骤（3）中4组PCR反应体系包括：第1组扩增KIR3DL2基因第1号外显子的反应体系：10×LA buffer 2.5μl；2.5 mM dNTP 2.0μl；25 mM MgCl₂ 1.8μl；引物浓度50µM，5UTR和I2R各0.2µl，引物0.2µl；5U/µl LA‑Taq酶0.2µl；50‑100 ng/µl DNA 2.5µl；以H₂O 15.6µl补足至25µl；第2组扩增KIR3DL2基因第2号外显子至第6号外显子的反应体系：10×LA buffer 2.5μl；2.5 mM dNTP 2.0μl；25 mM MgCl₂ 1.8μl；引物浓度50µM，E1F 和i6R各0.2µl；5U/µl LA‑Taq酶0.2µl；50‑100 ng/µl DNA 2.5µl；以H₂O 15.6µl补足至25µl；第3组扩增KIR3DL2基因第6号外显子至第9号外显子的反应体系：10×LA buffer 2.5μl；2.5 mM dNTP 2.0μl；25 mM MgCl₂ 1.8μl；引物浓度50µM，F3和E9R各0.2µl；5U/µl LA‑Taq酶0.2µl；50‑100 ng/µl DNA 2.5µl；以H₂O 15.6µl补足至25µl；第4组扩增KIR3DL2基因第9号外显子的反应体系：10×LA buffer 2.5μl；2.5 mM dNTP 2.0μl；25 mM MgCl₂ 1.8μl；引物浓度50µM，E7F和3UTR各0.2µl；5U/µl LA‑Taq酶0.2µl；50‑100 ng/µl DNA 2.5µl；以H₂O 15.6µl补足至25µl。