[发明专利]一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR-SBT方法及试剂

说明书

本发明属于基因分型检测方法技术领域，具体涉及一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR‑SBT方法。本发明还涉及一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型试剂。本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决了KIR3DL2精确分型的问题，发挥PCR‑SBT对KIR3DL2分型操作简便、结果准确的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的相关应用将受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。

技术领域

本发明属于基因分型检测方法技术领域，具体涉及一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR-SBT方法。本发明还涉及一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型试剂。

背景技术

杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)属于免疫球蛋白样超家族，主要表达于NK细胞和T细胞表面，通过与靶细胞表面的HLA-I类分子(配基)相互作用传导抑制或者激活信号，从而调节NK细胞和T细胞的抑制和杀伤活性，在肿瘤免疫、清除老化变异细胞、抗感染免疫、母胎耐受、器官移植和自身免疫性疾病等生理病理过程中起着重要的作用。KIR3DL2属于抑制性KIR基因，研究显示这些抑制性KIR基因具有高度遗传多态性，分析明确其在人群中的分布对于研究调控NK细胞功能具有重要的意义。

KIR3DL2基因位于第19号染色体，由9个外显子编码。目前实验室检测KIR3DL2基因常见的分型技术为PCR-SSP、PCR-SSOP和PCR-SBT方法，前两种方法只能提供低分辨的结果，尚无法确定其等位基因型；PCR-SBT的方法可以提供高分辨的结果，但是由于KIR基因的特殊性，同一个基因座位上可能同时存在一个以上的等位基因，而且KIR基因家族具有高度相似性，KIR高分辨检测存在一定的难度，目前国外仅有少数实验室开展KIR3DL2基因的高分辨研究工作。现有的PCR-SBT方法只是针对KIR3DL2基因部分外显子，随着KIR3DL2新等位基因的不断发现，先前的方法如不及时进行改进和提升，则存在着漏检和错检的可能。因此有必要系统建立一种针对KIR3DL2基因编码区全长序列的高分辨分型的方法来解决目前的问题。

本发明提供了一种针对KIR3DL2基因全部编码区序列进行扩增和测序的PCR-SBT方法，最终获得准确的KIR3DL2高分辨分型的结果。

发明内容

针对现有技术中KIR3DL2基因分型技术的缺陷，本发明的第一个目的在于提供了一种用于人类杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIR3DL2基因的PCR-SBT高分辨测序分型方法，本发明所提供的方法可以对KIR3DL2基因全部编码区序列进行分析，获得准确的KIR3DL2等位基因分型结果，解决了现有KIR3DL2基因分型技术存在的问题。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于：所述方法对KIR3DL2基因编码区全长序列包括第1号外显子至第9号外显子进行分组PCR扩增和测序分型，并包括以下步骤：

(1)设计并合成PCR扩增引物和测序引物，针对KIR3DL2基因特异性序列；

(2)制备人基因组DNA；

(3)分四组PCR反应扩增人基因组DNA中KIR3DL2基因第1号外显子至第9号外显子序列；

(4)将步骤(3)得到的扩增产物进行双酶切纯化；

(5)提供寡核苷酸测序引物，将步骤(4)得到的双酶切纯化产物进行测序PCR反应；

(6)将步骤(5)得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，并进行毛细管电泳测序；

(7)将步骤(6)获得的序列通过软件分析，确定其基因型；

所述步骤(1)中PCR扩增引物序列分别为：