[发明专利]一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR-SBT方法及试剂

权利要求书

1.一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于：所述方法对KIR3DL2基因编码区全长序列包括第1号外显子至第9号外显子进行分组PCR扩增和测序分型，并包括以下步骤：

(1)设计并合成PCR扩增引物和测序引物，针对KIR3DL2基因特异性序列；

(2)制备人基因组DNA；

(3)分四组PCR反应扩增人基因组DNA中KIR3DL2基因第1号外显子至第9号外显子序列；

(4)将步骤(3)得到的扩增产物进行双酶切纯化；

(5)提供寡核苷酸测序引物，将步骤(4)得到的双酶切纯化产物进行测序PCR反应；

(6)将步骤(5)得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，并进行毛细管电泳测序；

(7)将步骤(6)获得的序列通过软件分析，确定其基因型；

所述步骤(1)中PCR扩增引物序列分别为：

KIR3DL2基因第1号外显子的扩增引物：

5UTR 5'-GCCTCATGCAAGGTAGAAAGA-3'

I2R 5'-TTGGGGAMGGACTCACCCATGA-3'

KIR3DL2基因第2号外显子至第6号外显子的扩增引物：

E1F 5'-GTCGTCAGCATGGYGTGC-3'

i6R 5'-AGACAGGCCCTCATTCACAG-3'

KIR3DL2基因第6号外显子至第9号外显子的扩增引物：

F3 5'-CTTCACCCACAGAACCAAGC-3'

E9R 5'-CTTCACCCACAGAACCAAGC-3'

KIR3DL2基因第9号外显子的扩增引物：

E7F 5'-CATCCTCCTCCTCTTCTTTCTCCTTT-3'

3UTR 5'-CAGAAGGCTGAAAGATAGTCTGA-3'；

所述步骤(3)中4组PCR反应体系包括：

第1组扩增KIR3DL2基因第1号外显子的反应体系：10×LA buffer 2.5μl；2.5mM dNTP2.0μl；25mM MgCl₂ 1.8μl；引物浓度50μM，5UTR和I2R各0.2μl，引物0.2μl；5U/μl LA-Taq酶0.2μl；50-100ng/μl DNA 2.5μl；以H₂O 15.6μl补足至25μl；

第2组扩增KIR3DL2基因第2号外显子至第6号外显子的反应体系：10×LA buffer 2.5μl；2.5mM dNTP 2.0μl；25mM MgCl₂ 1.8μl；引物浓度50μM，E1F和i6R各0.2μl；5U/μl LA-Taq酶0.2μl；50-100ng/μl DNA 2.5μl；以H₂O 15.6μl补足至25μl；

第3组扩增KIR3DL2基因第6号外显子至第9号外显子的反应体系：10×LA buffer 2.5μl；2.5mM dNTP 2.0μl；25mM MgCl₂ 1.8μl；引物浓度50μM，F3和E9R各0.2μl；5U/μl LA-Taq酶0.2μl；50-100ng/μl DNA 2.5μl；以H₂O 15.6μl补足至25μl；

第4组扩增KIR3DL2基因第9号外显子的反应体系：10×LA buffer 2.5μl；2.5mM dNTP2.0μl；25mM MgCl₂ 1.8μl；引物浓度50μM，E7F和3UTR各0.2μl；5U/μl LA-Taq酶0.2μl；50-100ng/μl DNA 2.5μl；以H₂O 15.6μl补足至25μl；

所述步骤(5)中寡核苷酸测序引物序列分别如下：

5UTR 5'-GCCTCATGCAAGGTAGAAAGA-3'

I2R 5'-TTGGGGAMGGACTCACCCATGA-3'

i1SF1 5'-CTGTTCTTGGCAGCAGGTA-3'

i2R2 5'-GTCTCACCCCAGTCTTCAC-3'

i2F2 5'-CTTAGAAAGYGGAAATGGGAG-3'

i3R2 5'-ACAGTKATTCTTCCCACCACA-3'

i3F1 5'-AAGACAAATGGAGGGACCTG-3'

i4R1 5'-CCTCACCGAGTCAGTCTCT-3'

i4F1 5'-GGAAATAGACATGAAGAGAGT-3'

i5SR1 5'-GTCTTCGTGTTCTCTCTGCA-3'

i5SF1 5'-AGGGTCCAACATTAGATAACA-3'

i6R 5'-AGACAGGCCCTCATTCACAG-3'

i6F1 5'-GTCAATCAAGAAATGAGACAA-3'

i7R2 5'-GCAATGGTCTGTGAGCTGAA-3'

i7SF1 5'-GGAGACAGAATCAATGGGAT-3'

E9R 5'-CTTCACCCACAGAACCAAGC-3'

E7F 5'-CATCCTCCTCCTCTTCTTTCTCCTTT-3'

3UTR 5'-CAGAAGGCTGAAAGATAGTCTGA-3'；

所述步骤(5)中测序PCR反应体系为：

5×buffer 2.0μl；Bigdye mix 1.0μl；寡核苷酸测序引物浓度3.2μM，选择18条寡核苷酸测序引物中任意一条，1.0μl；纯化后PCR产物以纯水进行1:1稀释后总计2.0μl；以H₂O4.0μl补足至10μl；

所述步骤(5)中测序PCR反应程序为：

96℃预变性1min，96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸4min，25个循环，然后冷却至12℃。