[发明专利]一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法及冻存液

摘要

一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法及冻存液，相较于现有的牙齿根尖部分切开的牙髓组织冻存方法复苏后组织块细胞爬出时间较短，爬出细胞状态较好，细胞传代后细胞呈涡旋状排列，排列相对紧密，边缘清晰透光性好，形态多为长梭形，效果接近于原代提取的牙髓干细胞。

主权项

1.一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取牙髓：采集完整无损的人的牙齿，放入干净培养皿中加入浓度为75％的医用酒精，没过牙齿30s，吸去医用酒精，向培养皿中加入含双抗的PBS溶液，轻轻冲洗牙齿，重复3次，直至完全去除牙齿表面的医用酒精，液压钳压碎，取出牙髓；(2)配制牙髓冻存液：所述的牙髓冻存液为由1.25％血清替代物、5％人血白蛋白、20％Cryosure DEX‑4组成的无血清培养体系‑基础培养基组成的冻存液；(3)冻存牙髓：将牙髓放置在装有4℃预冷牙髓冻存液的冻存管中，使牙髓完全浸没于冻存液中，将冻存管放置在装有异丙醇的程序冻存盒中，随后将程序冻存盒放置于‑80℃条件下过夜，然后液氮永久保存；(4)牙髓复苏：取冻存的牙髓，快速放置37℃水浴中解冻后加入10倍量的无血清培养基以稀释冻存液，弃培养基，用含双抗的PBS清洗后在牙髓组织中加入消化液，将牙髓剪成0.5mm³的组织块，消化10min，加无血清培养基终止消化，离心，弃上清，加入原代培养基700μL，将组织块悬液平铺于T25培养瓶中，第2天补培养液，之后半量换培养液直至组织块贴壁，第7天观察细胞爬出情况。