[发明专利]一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法及冻存液

说明书

一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法及冻存液，相较于现有的牙齿根尖部分切开的牙髓组织冻存方法复苏后组织块细胞爬出时间较短，爬出细胞状态较好，细胞传代后细胞呈涡旋状排列，排列相对紧密，边缘清晰透光性好，形态多为长梭形，效果接近于原代提取的牙髓干细胞。

技术领域

本发明涉及干细胞培养技术领域，特别涉及一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法及冻存液。

背景技术

牙髓位于牙髓腔内，是牙体组织中主要包含神经血管的疏松结缔组织，2000年，Gronthos等[Gronthos SM,Brabim J.Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs)in vitro and in vivo.Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97(25):13625-13630.]通过对人牙髓细胞的研究，发现了一种与骨髓间充质干细胞有着极其相似的免疫表型及形成矿化结节能力的细胞，细胞形态呈梭形，可多向分化，有着较强的克隆能力，这些由牙髓组织中分离出的成纤维状细胞称为牙髓干细胞(Dental Pulp Stem Cells,DPSCs)。

目前采用冻存方式来保存组织和细胞，但冻存过程中使用的冻存液由于存在大量的胎牛血清虽然可以为细胞提供必要的营养物质，，但也因为其成分不明确而存在携带细菌、病毒、蛋白传染性疾病或朊病毒的风险而且还有可能引起免疫反应，来源生产批次差异可能会造成不一致的影响，容易对干细胞生物学特性产生干扰，且为后续干细胞制品的分离纯化造成一定的困难。

而在冻存方法上，专利(一种牙髓或牙髓干细胞的冻存液及其冻存，申请公布号CN105941390 A)采用牙齿根尖部分切开方式进行冻存，因此本专利对根尖部分切开冻存及牙髓组织冻存两种方式进行对比，结果表明牙髓组织冻存方式的组织块细胞爬出时间较短，爬出的细胞状态较好。

因此发明一种适合牙髓组织冻存、保持牙髓干细胞活性的无血清冻存液及冻存复苏方法尤为重要。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法及冻存液，使牙髓组织复苏后原代提取的牙髓干细胞依旧保持活力及生物学特性。

本发明采用的技术解决方案是：一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法，包括以下步骤：

(1)提取牙髓：采集完整无损的人的牙齿，放入干净培养皿中加入浓度为75％的医用酒精，没过牙齿30s，吸去医用酒精，向培养皿中加入含双抗的PBS溶液，轻轻冲洗牙齿，重复3次，直至完全去除牙齿表面的医用酒精，液压钳压碎，取出牙髓；

(2)配制牙髓冻存液：所述的牙髓冻存液为由1.25％血清替代物、5％人血白蛋白、20％Cryosure DEX-4组成的无血清培养体系-基础培养基组成的冻存液；

(3)冻存牙髓：将牙髓放置在装有4℃预冷牙髓冻存液的冻存管中，使牙髓完全浸没于冻存液中，将冻存管放置在装有异丙醇的程序冻存盒中，随后将程序冻存盒放置于-80℃条件下过夜，然后液氮永久保存；

(4)牙髓复苏：取冻存的牙髓，快速放置37℃水浴中解冻后加入10倍量的无血清培养基以稀释冻存液，弃培养基，用含双抗的PBS清洗后在牙髓组织中加入消化液，将牙髓剪成0.5mm³的组织块，消化10min，加无血清培养基终止消化，离心，弃上清，加入原代培养基700μL，将组织块悬液平铺于T25培养瓶中，第2天补培养液，之后半量换培养液直至组织块贴壁，第7天观察细胞爬出情况。

所述的步骤(4)中消化液由浓度12mg/mL中性蛋白酶和浓度12mg/mLⅠ型胶原酶以及PBS组成，所述的中性蛋白酶：Ⅰ型胶原酶：PBS的体积比＝1:1:2。

所述的步骤(4)中第2天补培养液为1mL。