[发明专利]一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法及冻存液

权利要求书

1.一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取牙髓：采集完整无损的人的牙齿，放入干净培养皿中加入浓度为75％的医用酒精，没过牙齿30s，吸去医用酒精，向培养皿中加入含双抗的PBS溶液，轻轻冲洗牙齿，重复3次，直至完全去除牙齿表面的医用酒精，液压钳压碎，取出牙髓；

(2)配制牙髓冻存液：所述的牙髓冻存液为由1.25％血清替代物、5％人血白蛋白、20％Cryosure DEX-4组成的无血清培养体系-基础培养基组成的冻存液；

(3)冻存牙髓：将牙髓放置在装有4℃预冷牙髓冻存液的冻存管中，使牙髓完全浸没于冻存液中，将冻存管放置在装有异丙醇的程序冻存盒中，随后将程序冻存盒放置于-80℃条件下过夜，然后液氮永久保存；

(4)牙髓复苏：取冻存的牙髓，快速放置37℃水浴中解冻后加入10倍量的无血清培养基以稀释冻存液，弃培养基，用含双抗的PBS清洗后在牙髓组织中加入消化液，将牙髓剪成0.5mm³的组织块，消化10min，加无血清培养基终止消化，离心，弃上清，加入原代培养基700μL，将组织块悬液平铺于T25培养瓶中，第2天补培养液，之后半量换培养液直至组织块贴壁，第7天观察细胞爬出情况。

2.根据权利要求1所述的一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法，其特征在于，所述的步骤(4)中消化液由浓度12mg/mL中性蛋白酶和浓度12mg/mL Ⅰ型胶原酶以及PBS组成，所述的中性蛋白酶：Ⅰ型胶原酶：PBS的体积比＝1:1:2。

3.根据权利要求1所述的一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法，其特征在于，所述的步骤(4)中第2天补培养液为1mL。

4.根据权利要求1所述的一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法，其特征在于，所述的步骤(2)中血清替代物包括生长因子、激素、蛋白质、维生素及还原类物质、促贴壁物质、酶抑制剂以及微量元素。

5.一种牙髓组织冻存液，其特征在于，所述的牙髓组织冻存液为由1.25％血清替代物、5％人血白蛋白、20％Cryosure DEX-4组成的无血清培养体系-基础培养基组成的冻存液，所述的血清替代物由生长因子、激素、蛋白质、维生素及还原类物质、促贴壁物质、酶抑制剂以及微量元素组成。

6.根据权利要求5所述的一种牙髓组织冻存液，其特征在于，所述的生长因子由PDGF-AB、PDGF-BB、FGF、EGF、TGF-β1和bFGF组成。

7.根据权利要求5所述的一种牙髓组织冻存液，其特征在于，所述的维生素及还原类物质由氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、维生素B₃、维生素B₆、维生素B₁₂、肌醇、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸中的一种或几种组成。

8.根据权利要求5所述的一种牙髓组织冻存液，其特征在于，所述的促贴壁物质由胶原蛋白和纤连蛋白组成。

9.根据权利要求5所述的一种牙髓组织冻存液，其特征在于，所述的酶抑制剂为抗凝血酶Ⅲ，所述的微量元素由钠离子、磷离子、钙离子、镁离子、钾离子、氯化物、铁离子中的一种或几种组成。

10.根据权利要求5所述的一种牙髓组织冻存液，其特征在于，所述的所述的其他物质由胆固醇、胆红素、葡萄糖、甘油三酯、肌酐、AST、CPK、γ-GT、CK、GGT、重碳酸盐中的一种或几种组成。