[发明专利]浙江雪胆雌、雄株的组培快速繁殖方法

摘要

本发明公开了一种浙江雪胆的组培快速繁殖方法，利用已知性别的浙江雪胆雌、雄株的茎段作为外植体，还包括以下步骤：茎段的消毒、腋芽的启动培养、无菌苗茎段的增殖培养/快速扩增、叶片愈伤组织的诱导和不定芽的分化培养、生根培养、移栽。本发明成功实现了浙江雪胆雌、雄株的组培快繁，可以短时间内快速培育出大量已知性别的试管苗，为该极小种群的恢复提供一条切实可行的繁殖方式，同时也为中药材GAP种植提供一种切实可行的开发项目。

主权项

1.浙江雪胆的组培快速繁殖方法，其特征在于利用已知性别的浙江雪胆雌、雄株的茎段作为外植体，依次进行以下步骤：1)、取材：于5～6月开花期，分别选择浙江雪胆的雌株和雄株的块茎进行种植，直至块茎上抽出新的茎段；2)、茎段的消毒：当步骤1)所得的茎段为只带有1～2个节的短茎段时，直接取用该短茎段；当步骤1)所得的茎段为带有＞2个节的长茎段时，将长茎段分割成带有1～2个节的短茎段；将所述短茎段进行清洗和灭菌，得消毒后茎段；3)、腋芽的启动培养：将消毒后茎段按照形态学的上端朝上、下端朝下插入到启动培养基上，进行腋芽的诱导；所述启动培养基为MS+BA 0.5～2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.9～7.0g/L,pH 5.8～6.0；诱导培养条件为：于22～26℃进行光/暗交替培养；当启动培养基上的茎段的腋芽萌发伸长至4～6cm时，结束启动培养；4)、无菌苗茎段的增殖培养/快速扩增：将步骤3)所得的腋芽切成带1～2个节的茎段，转接于增殖培养基上进行培养，增殖培养基为改良MS+BA 0.5～1mg/l+NAA 0～0.1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.2～7.3g/l，pH为5.8～6.0；增殖培养条件为：于22～26℃进行光/暗交替培养；待增殖培养基上的茎段的腋芽萌发伸长生长为带有3‑5个节，且节上具有鸟足状复叶时，结束培养，得无菌苗；5)、叶片愈伤组织的诱导和不定芽的分化培养：取步骤4)所得的鸟足状复叶，在鸟足状复叶的每个小叶片的主脉及叶柄上间隔3～5mm切割一次，然后接种到愈伤组织诱导/不定芽分化培养基上进行诱导；所述愈伤组织诱导/不定芽分化培养基为以下任一：愈伤组织诱导/不定芽分化培养基Ⅰ为含B5有机物的MS+NAA 0.75mg/l+BA 0.45mg/l+30g/l蔗糖+琼脂6.9～7.0g/l,pH 5.8～6.0；愈伤组织诱导/不定芽分化培养基Ⅱ为含B5有机物的MS+BA 1mg/L+ZT 0.5mg/L+GA₃ 0.5mg/l+30g/l蔗糖+琼脂6.9～7.0g/l,pH 5.8～6.0；所述诱导条件为：先于22～24℃暗培养2周然后转入22～26℃的光/暗交替培养；小叶片切口处形成愈伤组织，当此愈伤组织上分化获得高度为4～6cm的不定芽时，结束诱导培养；6)、生根培养：将步骤4)所得的无菌苗，或者步骤5)所得的不定芽转入生根培养基中进行生根培养；生根培养的条件为：先于22～24℃暗培养2～3天，然后转入22～26℃的光/暗交替培养；当无菌苗/不定芽的基部产生长度≥3cm的6～10条根时结束生根培养；所述生根培养基为以下任意一种：改良MS+IBA 0.2～0.4mg/l+蔗糖20g/l+琼脂7.2～7.3g/l，pH 5.8～6.0，改良MS+NAA 0.02～0.04mg/l+蔗糖20g/l+琼脂7.2～7.3g/l，pH 5.8～6.0；7)、移栽：将步骤6)所得的生根幼苗取出后，进行移栽。