[发明专利]浙江雪胆雌、雄株的组培快速繁殖方法

说明书

本发明公开了一种浙江雪胆的组培快速繁殖方法，利用已知性别的浙江雪胆雌、雄株的茎段作为外植体，还包括以下步骤：茎段的消毒、腋芽的启动培养、无菌苗茎段的增殖培养/快速扩增、叶片愈伤组织的诱导和不定芽的分化培养、生根培养、移栽。本发明成功实现了浙江雪胆雌、雄株的组培快繁，可以短时间内快速培育出大量已知性别的试管苗，为该极小种群的恢复提供一条切实可行的繁殖方式，同时也为中药材GAP种植提供一种切实可行的开发项目。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种浙江雪胆雌、雄株的组培快速繁殖方法。

背景技术

植物是药物的天然宝库之一。植物产生的用于自身防御的一些化合物被人类开发利用来防病治病。由于生境的破坏和掠夺式的采挖，导致很多中药资源蕴含量下降，甚至耗竭，一些种类濒临灭绝(黄璐琦,2001)。植物组织培养技术在植物快速繁殖、保护和增强有用的次生代谢产物的水平和含量，以满足药物的需求并减少原位采收等方面拥有巨大的潜力(Bapat等，2008)。该技术在药用植物资源，特别是对濒危药用植物资源保护方面的应用，对中国有着特殊的意义，因为中国是世界上使用和出口药用植物原料最多的国家(高文远肖培根，2008)。

雪胆属(Hemsleya)植物为葫芦科(Cucurbitaceae)多年生草质藤本植物。该属植物主产于亚洲的热带和亚热带地区，约27种，我国有25种，其中21种为我国特有(Flora ofChina Editorial Committee，2011)。

该属植物常以块茎入药，其主要成分是葫芦烷型化合物及其糖甙类和齐墩果烷型化合物及其糖甙类，具有抗菌、抗炎、溶血、抗癌等活性(聂瑞麟和陈宗莲，1986；白敏,等，2012)。其中葫芦烷型化合物如雪胆素(雪胆甲素、雪胆乙素)是重要的中药原料药，是生产雪胆素片、雪胆素胶囊的原料药，主要用于治疗菌痢、肠炎、支气管炎、急性扁桃体炎等症(曾祥飞等，2016；中国科学院中国植物志编辑委员会，1986；李德珠，1993)。随着雪胆复方制剂或粗提物广泛应用于临床，雪胆资源不断得到开发利用，野生资源遭到过度采挖，部分区域雪胆资源已濒危或完全绝种，因此开展人工驯化栽培，缓解资源紧缺势在必行(陈翠等，2016)。

浙江雪胆(H.zhejiangensis C.Z.Zheng)为郑朝宗1985年发表的雪胆属一新种(郑朝宗，1985)，分布于浙江泰顺乌岩岭、龙游等海拔800m以下的山谷灌丛和竹林下。浙江雪胆野生个体数量少，分布范围狭窄，由于其本身的生物学原因(雌雄异株、雌花先开，雄花后开)导致其自然条件下授粉困难、果实产生少、果实易腐烂、种子萌发困难等(王蒙蒙等，2008；雷祖培等，2010)，因此，2017年该物种被浙江省林业厅列为极小种群保护物种，因此迫切需要对浙江雪胆的野生资源进行复壮、迁地保护及建立组培快繁体系进行大面积人工栽培的研究。

传统上雪胆的繁殖主要通过块茎切块进行，由于块茎本身供应不足以及这种繁殖容易传播病菌，所以这种繁殖方式受到限制。地上茎的扦插繁殖一方面不容易成活，另一方面也很容易传播疾病(杨王伟，2014)。郭乔仪等(2016)的研究也表明大籽雪胆采用块茎分离繁殖、压蔓繁殖的繁殖率低，在实际生产中无实用价值。用种子进行繁殖，由于种子的休眠和不可预测的性别比是两个与种子繁殖有关的主要问题。雌雄异株植物，雄株在自然界中占主导地位，只有当植物开花时才能确定性别。由于雌株与结实相关，因此高比例的雌/雄比对于繁殖是极其重要的。